近年来,定向改造基因组DNA序列的基因编辑技术为推进生命科学领域基础研究提供了巨大动力。基因编辑主要包括锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活效应因子核酸酶（TALEN）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）三类技术,其中CRISPR/Cas9技术因具有操作简单、覆盖度高、脱靶率低等优势,迅速成为基因组编辑的主流技术并得到广泛应用。全基因组的功能分析是当前科学研究的主要趋势,基于Cas9蛋白的编辑体系已逐渐成为全基因组功能分析的强力工具,构建全基因组敲除个体库将快速推动基因功能研究、种质创制与遗传改造以及疾病的预防和治疗等相关研究。目前在斑马鱼、果蝇、水稻等物种中已实现了个体水平的大规模基因敲除,发现了多个对生长发育具有重要影响的关键基因,极大推动了基础研究、医疗和农业等领域的发展。作为重要的鳞翅目模式生物,家蚕的研究对昆虫学基础研究和害虫防控有重要的意义。家蚕较早完成了全基因组测序并且建立多种遗传操作技术平台,但是绝大多数的基因功能还未知,因此利用基因编辑技术构建全基因组敲除库,能够高通量的筛选功能基因,加快功能基因组的研究与注释。本实验室已在家蚕BmE细胞中构建CRISPR全基因组编辑文库,利用细胞文库筛选操作简便、周期短,目前已实现家蚕必需基因/非必需基因、温度响应基因以及BmNPV（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus）侵染过程中关键基因的筛选,证实CRISPR全基因组编辑文库在家蚕细胞研究中使用简便且高效。家蚕个体库的构建虽然周期长、工作量大,但更有利于发现突变品系及筛选功能基因,因此构建个体库也至关重要。在本研究中,我们进行了混合质粒文库的注射和突变体库构建工作,获得了520个sgRNA×Cas9杂交品系。对家蚕突变体库中每个个体的sgRNA与靶位点进行测序分析,深入探索突变体库的分子检测方案,系统分析家蚕的基因编辑规律,推动家蚕基因组编辑研究进程,以期更好地为家蚕个体库构建以及编辑实验的研究和sgRNA的优化设计提供理论和技术支持。本研究的主要结果和结论如下:1.家蚕个体突变体库的制备以及sgRNA的规模化检测与分析家蚕突变体库的构建采用“规模化注射蚕卵—G1代阳性筛选—多次回交得到G3代—与Cas9杂交得到F1代杂交品系”的方法,获得了520个敲除品系。为减少工作量,采用sgRNA文库（94000个sgRNAs,覆盖16198个基因）混合注射的方式,因此需要鉴定后续每个转基因品系的sgRNA。我们分别采用一代测序（Sanger Sequencing）和二代测序（Next Generation Sequencing）的方法,对520个敲除品系的1560个个体进行了sgRNA序列的检测（每个品系两雄一雌三个重复,分为组1、组2和组3）,并对测序结果进行统计分析。我们共检测到267种sgRNA,覆盖188个基因,且个体库中存在部分个体有多个sgRNA。经过统计分析发现G1代单sgRNA个体仅占43%,G3代个体中单sgRNA个体比例升高至75%,其子代F1代单sgRNA个体占比升高至86%。另外将G3代多sgRNA个体与遗传至F1代个体中的sgRNA情况对比,发现74%的sgRNA在F1代中发生分离。以上结果说明注射混合CRISPR载体文库得到的多sgRNA个体能够通过回交分离,得到单sgRNA个体,这将极大的减少构建家蚕突变体库的工作量。2.家蚕个体突变体库中Cas9介导的靶位点双链断裂修复研究我们对520个家蚕敲除品系靶位点编辑结果进行系统分析,进一步研究编辑后家蚕个体中的主要修复类型及修复机制。结果显示家蚕敲除品系的平均突变效率为63.8%;突变类型以碱基缺失类型为主,占总突变类型的70.54%,其比例高于插入（占比4.80%）、替换（占比6.92%）等其他突变类型。接下来,我们分别对插入和缺失的情况进行进一步分析,结果表明碱基缺失多倾向于发生在切割位点上游区域,多为1-20 bp的小片段缺失,碱基插入多以单碱基为主,占插入类型的62.56%;大多数的1-2 bp的小片段插入以上游核苷酸为模板修复。以上结果表明在家蚕中由基因编辑产生的双链断裂修复具有一定倾向性。3.家蚕个体突变体库中影响突变效率相关因素的分析突变体库的大量突变数据为分析影响家蚕个体突变效率的因素提供了依据,我们分析了三组样品靶位点的突变情况以及影响编辑效率的若干因素。三组样品之间突变率的相关性较高,对靶位点GC含量的分析发现,家蚕靶位点突变效率与GC含量成正相关性;对PAM序列进行分析发现当PAM为AGG或CGG时,更有利于CRISPR/Cas9系统对靶位点序列进行编辑;对靶位点序列特征分析发现鸟嘌呤在PAM序列近端的-1和-2位置,以及腺嘌呤在靶位点3’端的位置,有利于发生靶位点编辑;胸腺嘧啶在靶位点5’端（-17至-20位置）有利于发生靶位点编辑,而在3’端（-1至-7位置）可能会抑制编辑。我们进一步分析了所有检测靶位点中种子区2nt和3nt基序的分布与突变效率的潜在关系,发现含有“A/CA/C”二核苷酸更容易诱导突变,而含有“TT”的三核苷酸不利于诱导突变。此外,我们探究了突变效率与靶位点表观修饰的关系,分析了家蚕编辑位点附近（前后3kb）的DNA-6mA甲基化水平,发现家蚕DNA-6mA修饰水平越高,其基因编辑效率越低,推测DNA甲基化可能影响Cas9蛋白与靶位点的结合。结合家蚕胚胎时期转录组数据,分析显示突变效率与靶基因表达量以及家蚕性别无显著关系。以上结果为我们设计和优化家蚕sgRNA和后续规模化种质创制提供参考。综上所述,本研究制备了小规模家蚕敲除个体库,并对获得的520个家蚕敲除品系的sgRNA和靶位点编辑结果进行系统分析,发现了sgRNA整合和遗传的规律,分析了CRISPR在家蚕中的编辑特征,探讨了家蚕中Cas9介导的双链断裂修复规律与影响编辑效率的相关因素,为家蚕sgRNA设计和优化以及后续规模化种质创制提供参考。