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CyclinE(CycE)是细胞从G1期转换到S期的限制性因子,已在多种生物中被证明与细胞增殖以及DNA复制相关。CycE基因还与多种类型癌症的发生发展关系密切。家蚕是完全变态昆虫,经过卵、幼虫、蛹和成虫等发育阶段完成其生命周期,其问形态变化很大,涉及很多组织器官的更替,但其调控机制尚未解明。对家蚕CycE蛋白的研究有助于了解其功能,并可能更好地阐明细胞周期蛋白在家蚕生长发育的整个过程中的作用。为进一步分析家蚕cycE基因的功能,本文从家蚕细胞(BmN)中克隆了两种不同剪切方式的cycE基因,分别命名为cycE1173和cycE837,通过分析这两种cycE基因剪切体的表达状况,以期找到其表达调控规律,建立研究cycE基因的细胞模型,为进一步研究该基因调控作用提供基础信息。主要研究内容和结论如下:
1.从家蚕细胞中克隆了2种cycE,长度分别为837bp和1173bp,编码279aa及391aa,都具有7个外显子,cyclinbox和PEST结构。构建了杆状病毒表达载体bacmid-cycE837/1173-eGFP,融合eGFP后在BmN和Sf9细胞中进行了亚细胞定位实验,并通过Westernblotting验证表达产物。亚细胞定位结果表明cycE1173和cycE837在不同的细胞系中都定位于细胞核,但在Sf9细胞中存在cycE1173荧光逐渐聚集到核膜,核心荧光弱化的现象,可能与降解有关;在BmN细胞中,cycE1173和cycE837的荧光分布均匀。Westernblotting结果显示在Sf9细胞中表达的cycE1173出现两条降解条带,而其它的融合蛋白并无这种降解情况,说明CycE1173和CycE837之间存在蛋白稳定性的差异,cycE1173更容易降解,推测其与细胞周期调控的关系更为密切。其降解有利于细胞进入细胞周期的下个环节。
2.通过实时荧光定量PCR的方法检测了家蚕cycE基因在家蚕5龄第3天幼虫的血液、中肠、脑、脂肪体、马氏管、精巢、及丝腺等组织的表达情况,数据显示cycE基因在丝腺组织的表达量要远远高于其他组织的表达水平。同时利用紫外刺激(50mJ/cm2)BmN细胞后,分析cycE基因转录水平的影响。结果表明,cycE基因表达量在紫外刺激之初迅速下降,后上升,在3h的时候达到最大值,随后cycE基因的表达水平会逐渐减低并趋于稳定,其原因可能为当BmN细胞在紫外辐射下,将会造成细胞DNA的损伤,此时细胞需要进行DNA修复,cycE基因的高表达能造成细胞周期的停滞,以利于细胞DNA的修复。该结果暗示了在DNA损伤的情况下,家蚕cycE基因参与DNA的修复。
3.构建了载体piggybac-cycE转染BmN细胞,随后进行了稳转细胞株的筛选,为进一步分析cycE基因在家蚕中的功能奠定基础。