【摘 要】
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草甘膦是一类广谱灭生性、内吸传导型除草剂。由于其同样杀死农作物而限制了使用时间和使用范围。随着抗草甘膦转基因作物种植面积在全球领域扩大化,草甘膦的应用也越发广泛。但在报道的抗草甘膦转基因作物中驱动草甘膦抗性基因表达的启动子是组成型启动子,使这些转基因作物的所有部位和所有发育及代谢阶段都持续表达草甘膦抗性基因,这无疑会造成植物代谢上的巨大负担,且在物质和能源上造成巨大浪费。基于花发育过程突变体研究而
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草甘膦是一类广谱灭生性、内吸传导型除草剂。由于其同样杀死农作物而限制了使用时间和使用范围。随着抗草甘膦转基因作物种植面积在全球领域扩大化,草甘膦的应用也越发广泛。但在报道的抗草甘膦转基因作物中驱动草甘膦抗性基因表达的启动子是组成型启动子,使这些转基因作物的所有部位和所有发育及代谢阶段都持续表达草甘膦抗性基因,这无疑会造成植物代谢上的巨大负担,且在物质和能源上造成巨大浪费。基于花发育过程突变体研究而从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中分离克隆的Leafy分生组织特异性基因,在植物的开花发育过程中起着极为重要的作用。经研究分析此基因的5’端启动子区具有顶端分生组织特异性表达功能。鉴于Leafy具有芽端分生组织专一性表达特征,本研究采用Leafy组织特异性启动子来驱动5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)在转基因植株的芽端特异提高CP4EPSPS表达量来抵抗草甘膦的影响。Leafy驱动的CP4EPSPS在芽端特异表达可以降低转基因植株的代谢负担和能源浪费,而且转基因植物在幼芽部位特异性表达CP4EPSPS基因,在喷洒草甘膦时,可显著降低转基因植物受伤害的程度。扩大了转基因植物与杂草之间对除草剂的敏感差别程度,可以使转基因植物在使用除草剂时受伤害的程度降至最低,提高农作物生产能力。本研究用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了2.0kb的Leafy基因启动子序列,并对其序列进行PLACE及PlantCARE在线分析表明该启动子有TATA-box及CAAT-box等启动子特定结构,还有多种顺式作用元件如光响应元件、ABA响应元件及MYB结合位点。将Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S组成型启动子,用其驱动嵌合了二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽序列的CP4EPSPS基因,同时整合调控报告基因gus的编码区,构建植物表达载体p3301-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS,重组质粒经农杆菌介导转化烟草。对筛选出的烟草株系进行PCR、RT-PCR(?)测,证明植物表达载体成功整合到烟草基因组中。对转基因烟草进行GUS组织染色分析表明,Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分,转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明,Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性,成熟的叶片不能抵抗草甘膦的毒性。结果表明,Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。
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