昆虫NPV垂直传递和PCR检测的研究

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昆虫核型多角体病毒(NPV)是一种重要的病原微生物和生物杀虫剂,不仅具有专一性强、对环境和人畜安全、不杀伤天敌等优点,而且在其应用后能在自然界中长期存在,从而引起病毒流行病的大发生,可在较长时间内自然控制害虫种群密度的增长,在害虫的持续控制研究中发挥着重要的作用。本文对室内保存的病毒株系HaNPV的毒力进行生物测定并根据实验结果计算出LC30、LC50、LC70和LC90。用上述4种浓度感染健康的棉铃虫3龄幼虫,分别收集感染未致死的棉铃虫蛹进行传代饲养,对不同处理的各代间幼虫的死亡率、化蛹率、羽化率和平均单头蛹重等生物学特性参数进行了研究和分析,并用PCR方法对传代棉铃虫的蛹和卵进行检测,从而对NPV室内垂直传递作了比较系统和详细的研究。实验结果如下:(1)实验室保存病毒株系HaNPV的致死中浓度(LC50)和致死中量(LD50)分别为3.44×104PIB/ml和1995PIB。当用1.0×107 PIB/ml的浓度感染棉铃虫3龄幼虫时,其感染半致死时间(LT50)为4.77天,当浓度为1.0×106PIB/ml时,LT50为5.73天,用1.0×105PIB/ml的浓度感染时为6.63天。(2)用LC70、LC50和LC30的浓度感染寄主时,各处理的子一代(F1)和子二代(F2)的幼虫死亡率分别为15~50.42%、21.67~47.92%和12.22~34.44%,均远高于对照的7.50~8.33%;在子三代(F3)和子四代(F4)中,除了处理LC30在子三代(F3)中的幼虫死亡率(17.78%)明显高于对照(8.83%)外,其它处理与对照均无明显差异。(3)在幼虫化蛹率方面,亲代(F0)和子一代(F1)与对照之间存在明显差异。处理LC70、LC50和LC30的幼虫化蛹率分别为61.37~72.28%、77.31~87.36%和77.39~87.05%,处理LC90亲代(F0)的化蛹率仅为32.14%,均低于对照的93.69~96.63%;在子二代(F2)、子三代(F3)和子四代(F4)中,各处理与对照均差异不明显。(4)处理LC90、LC70、LC50和LC30的亲代和子代在羽化率方面也存在差异。<WP=9>在F0代中,处理LC90和LC70的羽化率分别为50.00%和51.52%,明显低于对照的85.99%;F1代中,处理LC70的羽化率(67%)也远低于对照(83.93%),其它处理与对照差异不明显;而在F2、F3和F4代中,处理和对照差异不明显。(5)各处理在平均单头蛹重方面与对照也有明显的差异,在亲代(F0)中,各处理(0.1996~0.2356g)与对照(0.3036g)之间差异极显著 。在子一代(F1)和子二代(F2)中,处理LC70和LC50与对照之间差异极显著,其它处理与对照无差异。各处理在子三代(F3)和子四代(F4)代中与对照无差异。(6)在参考其它昆虫NPV多角体蛋白基因核苷酸序列的基础上,根据棉铃虫多角体蛋白基因核苷酸序列,在其多态性丰富的区域设计引物(POLH1-F: 5’GTTAAGCCCGACACAATGAAGC 3’;POLH1-R: 5’ATGGGTTTGTAAAAGTTCTCCCA3’,以HaNPV的DNA为模板做PCR扩增,成功扩增出了目的片段并对PCR扩增片段进行回收、克隆和测序,测序结果表明所扩增的片段是HaNPV的多角体蛋白基因的部分序列。以纯的HaNPV的基因组为模板做PCR扩增,其检测水平可达到10fg。应用此检测体系从感染的虫卵和蛹中也成功检测到了病毒的存在。
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