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【研究背景】《2020中国心血管健康与疾病报告》明确指出,在我国缺血性心脏病是心血管疾病死亡的主要原因。心肌缺血损伤既包含短期引起的细胞凋亡,也包含长期进展的心肌重构,严重可导致心力衰竭及死亡。线粒体为心肌细胞提供源源不断的能量。在心肌缺血损伤中,线粒体氧化呼吸链严重受损,无法供应充足的能量,且线粒体复合体I和III产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),最终引起心肌细胞凋亡或坏死。血影蛋白βⅡ(βⅡ spectrin)是最常见的非红细胞血影蛋白亚型,在心脏中广泛表达。βⅡ spectrin常与丝状肌动蛋白(actin filaments,F-actin)和锚定蛋白等相互作用形成细胞骨架。除了参与形成细胞骨架之外,βⅡ spectrin也参与信号转导及膜蛋白的定位等过程。研究发现敲除βⅡ spectrin可导致心脏发育障碍,且在心力衰竭患者的心肌组织中βⅡ spectrin表达降低。而βⅡ spectrin在维持心脏功能及在心肌缺血损伤中的作用及机制尚未见报道。另有研究发现脑外伤患者的脑脊液中αII spectrin降解片段含量升高,且与损伤程度及预后相关。在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者的血清中能否检测到βⅡ spectrin降解片段,并且其含量变化是否具有临床指导意义都尚未见报道。【研究目的】1.观察βⅡ spectrin在小鼠心肌缺血损伤时的表达变化,检测AMI患者与非冠心病对照组相比血清中βⅡ spectrin降解片段含量变化;2.阐明βⅡ spectrin在正常心脏功能和心肌缺血损伤中的作用;3.明确βⅡ spectrin调控正常心脏功能和心肌缺血损伤的机制。【研究方法】1.为检测AMI患者与非冠心病对照组相比血清中βⅡ spectrin降解片段含量变化,连续纳入我院心内科AMI患者42例和非冠心病对照者64例,收集其一般基线资料和血清,利用Western blot检测血清中是否存在βⅡ spectrin降解片段,利用Elisa试剂盒检测血清中βⅡ spectrin降解片段的含量变化。2.为探究βⅡ spectrin在心肌缺血损伤中的表达变化,建立小鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型和小鼠原代心肌细胞(mouse neonatal cardiomyocytes,NCMs)缺氧复氧损伤模型,通过Western blot检测组织和细胞中βⅡ spectrin的蛋白表达变化,通过Q-PCR检测组织和细胞中βⅡ spectrin的m RNA水平变化。3.为探究βⅡ spectrin对心肌正常生理功能和心肌缺血损伤的作用,首先通过Cre-loxp体系构建他莫昔芬诱导型心肌特异性βⅡ spectrin敲除(βⅡ spectrin c KO)小鼠,分别在他莫昔芬诱导1周和5周后,利用超声心动图检测βⅡ spectrin c KO小鼠和对照小鼠心脏长轴收缩功能差异,采用WGA染色检测心肌横截面积差异,使用Masson染色检测心肌纤维化。将βⅡ spectrin c KO小鼠和对照小鼠在他莫昔芬诱导1周后进行Sham或I/R手术,手术24 h后,使用伊文氏蓝/TTC染色检测心肌梗死面积,并且使用TUNEL染色检测细胞凋亡水平。在Sham或I/R手术28天后,利用超声心动图检测βⅡ spectrin c KO小鼠和对照小鼠心脏长轴收缩功能,使用Masson染色检测心肌纤维化。设计靶向激活βⅡ spectrin启动子的sa RNA,利用心肌点注射含有sa RNA的腺病毒在心肌中过表达βⅡ spectrin,进行Sham或I/R手术,手术24 h后,使用超声心动图检测小鼠心功能,利用伊文氏蓝/TTC染色检测心肌梗死面积,利用TUNEL染色检测细胞凋亡水平。4.为探究βⅡ spectrin维持心肌功能的分子机制,提取心肌细胞总蛋白,利用免疫沉淀结合液相色谱串联质谱技术(IP-LC-MS/MS)鉴定潜在的可与βⅡ spectrin结合的蛋白,之后将这些蛋白进行GO和KEGG pathway富集分析,预测βⅡ spectrin发挥作用的可能机制。利用试剂盒分离心肌细胞线粒体,通过Western blot、免疫荧光、蛋白酶保护实验及免疫电镜,观察βⅡ spectrin在线粒体上定位。利用腺病毒敲低NCMs中βⅡ spectrin的表达,通过JC-1染色法检测心肌细胞线粒体膜电位的变化,Mito SOX染色法检测心肌细胞线粒体ROS含量变化,Seahorse细胞能量代谢仪检测线粒体氧化呼吸能力,利用试剂盒检测线粒体氧化呼吸链复合体I、II、III和IV的活性和细胞ATP含量。免疫共沉淀检测βⅡ spectrin与线粒体复合体I亚基NDUFS1和NDUFS3是否结合。提取βⅡ spectrin c KO小鼠和对照小鼠的心肌线粒体,通过蓝绿温和胶电泳(blue native PAGE,BNGE-page)及胶内活性实验检测线粒体复合体I的组装及活性。Western blot检测F-actin的蛋白表达。给予促F-actin聚合剂后,通过JC-1染色检测线粒体膜电位,Mito SOX染色特异性检测线粒体ROS含量,利用试剂盒检测线粒体复合体I的活性。【研究结果】1.在AMI患者血清中能够检测到βⅡ spectrin的降解片段,并且在AMI患者血清中βⅡ spectrin的降解片段水平较非冠心病对照组显著增加。2.在小鼠心肌I/R损伤和NCMs缺氧复氧损伤中,βⅡ spectrin蛋白表达降低,m RNA水平无明显变化,进一步研究发现βⅡ spectrin在NCMs缺氧复氧损伤中被降解为多个降解片段,其降解受钙蛋白酶(calpain)的调控。3.成功构建他莫昔芬诱导型βⅡ spectrin c KO小鼠,发现在他莫昔芬诱导1周后,βⅡ spectrin c KO小鼠与对照小鼠相比心功能无明显变化,但在他莫昔芬诱导5周后,βⅡ spectrin c KO小鼠与对照小鼠相比心脏收缩功能降低,心肌出现肥大,胶原纤维的比例也明显增加。4.将βⅡ spectrin c KO小鼠和对照小鼠在他莫昔芬诱导1周后进行I/R或Sham手术,手术24 h后发现,心肌特异性敲除βⅡ spectrin可加重I/R诱导的心脏收缩功能降低,显著增加I/R诱导的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。手术28天后发现,心肌特异性敲除βⅡ spectrin可加重I/R诱导的心肌重构,表现为加重心脏收缩功能降低和心肌纤维化。5.利用心肌点注射含有sa RNA的腺病毒来过表达βⅡ spectrin,发现恢复心肌βⅡ spectrin水平可减轻I/R诱导的心脏收缩功能降低,并且显著降低I/R诱导的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。6.利用IP-LC-MS/MS方法,结合GO分析和KEGG pathway分析,发现βⅡ spectrin与线粒体功能密切相关。电镜结果显示,βⅡ spectrin c KO小鼠在他莫昔芬诱导5周后心肌线粒体结构紊乱,表现为线粒体发生肿胀,线粒体嵴的数目减少。并且,在NCMs中敲低βⅡ spectrin可使线粒体膜电位降低,线粒体ROS增多,线粒体氧化呼吸功能受损。线粒体氧化呼吸链各复合体活性检测发现,敲低βⅡ spectrin明显降低线粒体复合体I活性,而对线粒体复合体II、III和IV的活性没有明显影响。7.我们进一步发现βⅡ spectrin定位于线粒体中,在线粒体内膜,外膜,膜间隙,基质,嵴上都有分布。并且βⅡ spectrin与线粒体复合体I的亚基NDUFS1和NDUFS3结合。虽然敲低βⅡ spectrin不会影响细胞内NDUFS1和NDUFS3蛋白表达。但是,敲低βⅡ spectrin显著抑制了线粒体复合体I的组装及活性。8.敲低βⅡ spectrin后,F-actin聚合降低。给予jasplakinolide促F-actin聚合剂可以恢复敲低βⅡ spectrin所引起的线粒体复合体I活性降低,线粒体膜电位降低,以及减少敲低βⅡ spectrin所引起线粒体ROS含量的增加。【结论】βⅡ spectrin是维持正常心脏功能和减轻心肌缺血损伤的重要线粒体骨架元件;其通过与F-actin结合后与线粒体复合体I共结合,调控线粒体复合体I组装和活性,来维持线粒体及心肌功能。