[研究背景]脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一,侵袭性生长的生物学特性使其治疗效果不尽理想。胶质瘤的形成可能是一个多因素参与、多步骤累积的病理过程。因此,从发生发展机制入手,探寻脑胶质瘤早期诊断和治疗的分子靶点依然是目前神经外科领域面临的重要课题之一miRNA是一类内源性的非编码RNA,其异常表达不仅与脑胶质瘤的发生发展密切相关,而且也为探寻脑胶质瘤新的诊断和治疗方法提供了全新的思路。我们前期构建了WHO不同分化级别的脑胶质瘤的差异miRNA表达谱和差异mRNA表达谱,并通过整合分析发现miR-107、miR-124、miR-149等可以调控多个靶基因的表达,而Rap1B等基因又可受miR-128a/128b、miR-149、miR-181b等多个miRNA调控。通过芯片数据进行Pearson相关性分析发现,Rap1B与miR-128a/b、miR-149和miR-181b呈明显负相关,提示Rap1B可能受这些miRNA分子直接调控,参与脑胶质瘤的发生和发展。本研究拟在此基础上进一步证实Rap1B是miR-128、miR-149及miR-181的直接调控靶基因,并证实它们在不同WHO分化级别的星形胶质细胞瘤中的表达变化,进而阐明miR-128、miR-149及miR-181通过靶向Rap1B对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响以及增强替莫唑胺(temozolomide, TMZ)对脑胶质瘤细胞化疗敏感性的作用机制。[Rap1B是miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d共同作用靶基因]通过targetScan、Picta和miRDB等软件分析,均预测到Rap1B是miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d的共同靶基因。通过分别构建含Rap1B和miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d不同结合位点的荧光素酶报告基因载体及突变体,荧光素酶活性分析、Real-time PCR和Western blotting等实验证实了Rap1B是miR-128、miR-149和miR-181a,miR-181b, miR-181c和miR-181d的共同作用靶基因,miR-128、miR-149和miR-181家族各成员可以在转录及转录后水平调控Rap1B的表达。[miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d及Rap1B在WHO不同分化级别星形胶质细胞瘤中的表达及相关性分析]我们收集了WHO不同分化级别的星形胶质细胞瘤组织及正常对照脑组织标本,通过Real-time PCR检测了miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d及靶基因Rap1B在星形胶质细胞瘤中的表达。我们的研究结果表明,miR-128和miR-181家族各分子的表达下调均与星形胶质瘤细胞瘤的发生密切相关,而miR-149的表达下调和Rap1B的表达上调与星形胶质细胞瘤的发生及恶性级别的进展密切相关。Pearson相关性分析证实了miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d与Rap1B在星形胶质细胞瘤中的表达呈负相关,这种负相关与WHO的分化级别进展无关。[miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d通过Rap1B对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响]研究表明,异常表达的miRNA分子通常可以发挥癌基因或者是抑癌基因的作用,参与肿瘤的发生发展。我们通过细胞克隆形成实验、MTT和Transwell实验分别检测了转染miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d等miRNAs mimics或干扰脑胶质瘤细胞中内源性Rap1B的表达后对脑胶质瘤细胞克隆形成能力、增殖和侵袭能力的影响。结果表明,miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d的过表达和Rap1B的敲除可以抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,说明,miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d等多个miRNAs均可能作为抑瘤性miRNAs,通过作用其共同的靶基因Rap1B影响脑胶质瘤细胞的侵袭性生物学行为。[miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d增强脑胶质瘤细胞化疗敏感性的作用机制研究]TMZ是一种新型的脑胶质瘤化疗药物,主要用于恶性脑胶质瘤或者是复发性脑胶质瘤的治疗。尽管TMZ对恶性脑胶质瘤的有效治疗率达45%,但仍有相当部分脑胶质瘤对TMZ治疗疗效欠佳或逐渐出现继发性耐药现象。现有的研究表明,miRNA作为潜在的脑胶质瘤治疗靶点,可增强TMZ对脑胶质瘤细胞的化疗敏感性。本课题进一步的研究表明,miR-128、miR-149和]miR-181a/b/c/d的过表达均可以增加TMZ对脑胶质瘤细胞的化疗敏感性。Rap1B作为miR-128、miR-149和miR-181a/b/c/d的直接调控靶基因,是RAS样小GTP结合蛋白家族成员Rap1的亚基,Rap1和Rho家族GTPases成员Racl、 RhoA和CDC42一样,均可以参与调控细胞骨架重塑、细胞的粘附和侵袭等多种生物学行为。我们的研究也进一步证实了TMZ可以通过上调miR-128、miR-149和miR-181家族分子的表达,靶向抑制Rap1B的表达,从而影响细胞粘附和细胞骨架相关蛋白CDC42、RhoA和N-cadherin的表达,调控细胞骨架蛋白F-actin的表达和分布,抑制脑胶质瘤细胞的侵袭性增殖。同时,]miR-128、miR-149和miR-181家族分子也可以通过靶向Rap1B介导的细胞骨架蛋白的重塑增强替莫唑胺对脑胶质瘤细胞的化疗敏感性。