中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是一种季节性繁殖物种,河蟹作为我国重要的水产经济物种,其特有的雄性生殖发育规律和精子保护体系为我们提供了很好的研究模型。研究中华绒螯蟹分子生物学的调控机制能直接的解析精子发生过程中精子质量控制的机理,为阐明甲壳动物的生殖调控机制和人工受精技术的发展提供理论基础和指导意义。本论文重点关注并研究泛素化蛋白酶体途径中的E3泛素连接酶CRLs对中华绒螯蟹精子发生的分子调节作用。蛋白质泛素化在控制多种细胞生理过程中发挥重要作用,参与调控包括细胞周期、基因转录、信号转导、增殖和分化等几乎所有的生命过程。关于CRLs在中华绒螯蟹的雄性生殖发育,尤其是Cullin基因如何参与调控精子发生过程的相关研究未见报道。结合基因组和转录组数据分析,采用分子克隆、精巢组织细胞培养、组织学分析、荧光定量PCR、蛋白印迹、免疫印迹等多种分子学手段对中华绒螯蟹Cullin基因进行以下六个方面的研究：(1)通过H&E染色并显微镜下观察中华绒螯蟹精子发生不同时期的形态学并根据生殖细胞在生精小管占的优势比例将其进行分类：5-6月(精原细胞期)；7-8月(精母细胞期)：9-10月(精细胞期)；11-12月(精子期)：4月开始,进入休止期。(2)成功体外培养中华绒螫蟹精巢组织观察精子形成的形态学变化,其精子形成主要由三个阶段构成,早期,中期和后期。(3)本课题结合中华绒螯蟹的精巢转录组(-2.31 Gb)和基因组(～439.3 Gb),发现Cullin家族在中华绒螯蟹一共存在5个Cullin基因,分别是Cull, Cul2, Cul3, Cul4和Cul5,并获得cDNA全长。(4)通过MrBayes构建分子进化树并发现Cullin家族在系统进化中具有高度的保守性。(5)实时荧光定量PCR分析Cullin家族具有相似的组织表达模式。(6)进一步探究Cullin4口何调控中华绒螯蟹的精子发生过程,其主要的调控机制如下：以增殖细胞核抗原PCNA为内源性蛋白分子Marker来研究Cullin参与调控中华绒螯蟹的精子发生。PCNA是一类高度保守的36-KDa核蛋白,在细胞周期各个时期均有表达,在S期达到最高值,参与DNA复制、损伤修复等多种细胞过程。研究发现Cu14与P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢发育不同时期的表达趋势一致,即在精母细胞期(八月)表达量最高,随着精子发育成熟而降低。为了阐明这一现象的原因,我们体外培养精巢组织细胞,然后通过添加NAE酶抑制剂MLN4924来观察底物蛋白P21,P27蛋白的积累情况。我们研究了抑癌基因P53、及研究已经证实的以Cu14为支架蛋白的CRLs泛素连接酶E3的特异性识别底物即细胞周期负调控因子P21和P27与Cu14的表达差异。MLN4924是最新研究发现的一种高度选择性NEDD8活化酶NAE的小分子抑制剂,能够抑制Cullin Neddylation,控制依赖于CRLs酶的泛素化途径,引起相关底物蛋白的积累,最终诱导细胞凋亡,衰老和自噬。我们通过添加浓度为1μM/LNAE酶抑制剂MLN4924,发现细胞周期负调控因子P21在细胞培养36-48小时后,P27蛋白在24-36小时过程中都有较大程度的积累,相比对照组DMSO。当DNA发生损伤时,就会诱发抑癌基因P53的表达量升高,从而刺激下游的蛋白激酶(CDK)负调控因子P21的转录水平升高,而P21除能抑制蛋白激酶CDK的激酶活性,从而在细胞周期进程中发挥重要作用,此外还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA结合,直接抑制DNA的合成。P53通过诱导不能修复的受损的生殖细胞凋亡来自发控制精子质量。P21、P27作为CRL4的底物蛋白随后会相应地被泛素化蛋白酶体途径降解,从而维持细胞周期的动态平衡。由于进化方面的保守性,Cu14可能还以相似的模式调控其它物种的生殖发育。