背景临床研究证实,血糖异常(包括低血糖、高血糖和血糖波动)与脑损伤之间存在着密切的相关性。葡萄糖是大脑的主要能量来源,其水平的升高、降低或波动均会影响神经功能,造成不同程度的脑损伤。急性严重低血糖会直接导致脑组织损伤;而高血糖和血糖波动会加重缺血性脑损伤,临床上常将高血糖和血糖波动视为缺血性卒中的危险因素。下面将分别阐述三种血糖异常与脑损伤的相关性:1、低血糖是糖尿病患者应用强化降糖方案的常见并发症,最易导致脑损伤。“葡萄糖再灌注性脑损伤”这一概念的提出,使人们对低血糖脑损伤发病机制重新认知,对传统低血糖救治进行反思。低血糖脑水肿是引发低血糖脑损伤的始动环节,研究低血糖脑水肿的病理机制,有可能为临床治疗低血糖脑损伤提供新的靶点和思路。2、高血糖是缺血性脑损伤的独立危险因素。研究资料显示,发生缺血性脑损伤的患者中15%-30%患有糖尿病。与血糖正常患者相比,高血糖患者卒中后死亡率更高、神经功能恢复更差、并发症更多、再发风险更大。因此,探索研究高血糖加重缺血性脑损伤的分子机制,为临床治疗并发糖尿病的缺血性脑损伤提供新的理论基础。3、血糖波动,不仅存在于糖尿病患者中,也存在于血糖代谢功能正常的个体中。在急性应激事件如缺血性卒中时,既往无糖尿病史的患者血糖仍会异常升高,此时给予降糖治疗,血糖可能会急剧下降,导致急性血糖波动。既往研究认为一定浓度的高血糖对缺血性脑损伤具有保护作用,然而在临床实践中发现,急性脑缺血后,患者的血糖水平波动较大,无法客观反映患者血糖水平变化对缺血性脑损伤的影响。同时临床研究证实急性血糖波动可加重缺血性脑损伤。迄今为止,有关急性血糖波动对缺血性脑损伤的影响及相关机制研究相对较少。因此,探索和研究急性血糖波动对缺血性脑损伤的影响及相关机制为临床治疗提供新的理论基础。目的1、探索低血糖脑水肿的分子机制,并为临床治疗寻找新靶点;2、研究血糖异常加重缺血性脑损伤的相关机制,尝试为临床治疗合并有糖代谢异常的缺血性卒中患者提供新思路。方法1、以水通道蛋白-4(aquaporins-4,AQP4)基因敲除小鼠为研究对象,通过腹腔注射胰岛素建立急性低血糖模型。首先,通过检测脑含水量,依文思蓝(evans blue,EB)渗透量以及紧密连接蛋白表达水平,评估AQP4敲除对血脑屏障的作用。通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测脑组织内炎症因子的表达水平,证明AQP4参与调节炎症反应。然后体外构建星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞非接触式共培养模型,通过小RNA干扰技术沉默星形胶质细胞上的AQP4,评估沉默后的星形胶质细胞在低糖条件下对内皮细胞功能的影响。通过酶联免疫吸附实验检测共培养体系内炎症因子的表达;应用免疫印迹方法评估过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在星形胶质细胞中的表达水平。最后,在共培养体系中加入PPAR-γ抑制剂,通过再次检测培养体系内炎症因子的表达,来探讨PPAR-γ是否参与了AQP4敲除对低血糖脑水肿的保护过程。2、以2型糖尿病小鼠为研究对象,通过电凝法建立大脑中动脉闭塞模型。首先,通过免疫荧光检测嗜中性粒细胞与中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular trap nets,NETs)在半暗带区域的表达,评估糖尿病与NETs形成的相关性。然后腹腔注射NETs抑制剂,通过神经功能评分、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色及脑含水量检测来评估糖尿病加重缺血性脑损伤与NETs的相关性。最后,通过检测小鼠脑组织内炎症因子的表达探讨高血糖是否通过NETs介导的炎症反应加重缺血性脑损伤。3、以正常C57/BL小鼠为研究对象,通过电凝法建立大脑中动脉闭塞模型,然后通过腹腔间断性注射50%葡萄糖模拟急性血糖波动。首先,通过免疫荧光检测嗜中性粒细胞与NETs在半暗带区域的表达,评估血糖波动与NETs形成的相关性。然后腹腔注射NETs抑制剂,通过神经功能评分、TTC染色及脑含水量检测评估急性血糖波动加重缺血性脑损伤是否与NETs相关。最后,通过检测小鼠脑组织内炎症因子的表达探讨急性血糖波动是否通过NETs介导的炎症反应加重缺血性脑损伤。结果1、在低血糖模型中,AQP4敲除对低血糖脑损伤具有保护作用。(1)体内实验:AQP4敲除减轻低血糖脑水肿,减轻低血糖对血脑屏障的破坏;低血糖上调炎症因子,AQP4敲除抑制低血糖对炎症因子的上调。同时,低血糖抑制PPAR-γ的活性,而AQP4敲除激活PPAR-γ的活性。(2)体外实验:低糖条件培养的原代星形胶质细胞在沉默AQP4后,PPAR-γ表达增加,炎症因子释放降低;通过与内皮细胞共培养后,低糖条件对紧密连接蛋白的下调作用降低。2、在糖尿病缺血性脑损伤模型中,高血糖诱导产生NETs,并通过上调炎症反应加重缺血性脑损伤。(1)高血糖导致脑缺血后嗜中性粒细胞数量增加。(2)高血糖促进NETs的形成。(3)抑制NETs的产生可改善脑缺血后神经功能损伤,降低脑梗死体积,减轻脑水肿。(4)NETs的形成加重炎症反应。3、在急性血糖波动模型中,急性血糖波动诱导产生NETs,并通过上调炎症反应加重缺血性脑损伤。(1)急性血糖波动促进脑缺血后嗜中性粒细胞数量增加。(2)急性血糖波动促进NETs的形成。(3)抑制NETs的产生可改善由血糖波动所加重的脑缺血后神经功能损伤,降低脑梗死体积,减轻脑水肿。(4)NETs的形成加重炎症反应。结论1、在急性脑水肿发生时,AQP4敲除通过激活PPAR-γ,抑制炎症反应,减轻低血糖脑水肿,降低低血糖对血脑屏障的破坏。2、在糖尿病缺血性脑损伤发生时,糖尿病加重缺血性脑损伤,影响神经功能恢复。糖尿病诱导的NETs通过上调炎症反应加重缺血性脑损伤。3、在脑缺血后急性血糖波动发生时,缺血性脑损伤加重,影响神经功能恢复。NETs通过调节炎症反应参与血糖波动加重缺血性脑损伤的过程。