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棉花是我国重要的经济作物,由于棉籽的含油量在30%左右,棉花因此也成为重要的油料作物。目前,我国的食用油对外依存比例在60%以上,提高棉籽的含油量可以增加我国植物油的供应,缓解供求短缺的问题。 根据植物油脂代谢途径,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)与乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)被认为是控制碳源流向的两个重要催化酶,它们通过竞争共同底物丙酮酸,分别实现蛋白质和油脂的合成。利用现代生物技术,干涉PEPCase基因的活性,就可以使碳源更多的向油脂合成的支路流动。本研究利用RNAi技术抑制PEPCase的表达,以达到提高油分含量的目的。另外,通过超表达油脂合成过程中的关键基因二脂酰甘油酰基转移酶GhDGAT,并构建了不同启动子(35s启动子和αGP种子特异表达启动予)的超表达载体,也为油分的提高创造了可能。主要研究结果如下: 1.通过NCBI检索陆地棉GhPEPC1(GenBank: AF008939.1)全序列,Blast比对PEPC基因家族的保守区域,设计陆地棉GhPEPC1基因的保守域(PPC)引物,同时根据陆地棉GhPEPC13端(PEPC1)序列设计引物,扩增得到与陆地棉GhPEPC1基因碱基序列完全一致的目标片段。同理,检索得到棉花a-球蛋白种子特异启动予以及二脂酰甘油酰基转移酶GhDGAT基因的EST序列,设计特异引物,克隆得到相关基因。 2.利用干涉载体pHellsgate4和超表达载体pK2GW7.0,将目的基因片段分别连接到相应载体上,经过PCR和酶切验证,得到了符合预期的重组载体。 3.分别以YZ1和Y668两个陆地棉品种为受体,经组织培养和农杆菌介导的遗传转化后,获得转基因植株;获得以YZ1为受体的PPC转基因植株22个,PEPC1转基因植株14个;以Y668为受体得到PPC转基因植株11个,PEPC1转基因植株21个。此外,以YZ1为遗传背景,共获得10个转35s-GhDGAT T0植株和8个转αGP-GhDGATT0植株。 4.对YZ1转基因植株,进行PCR阳性检测和Southern杂交,获得转基因阳性植株和转基因的拷贝数;并利用荧光定量PCR对GhPEPC基因不同转基因植株进行基因表达量的检测,结果表明转基因植株的表达量均有不同程度的降低。以YZ1为遗传背景的转基因株系PPC-1,PPC-1-8,PPC-8已经得到T2种子,种子蛋白质含量比野生型对照下降了16.5%-18.5%,总含油量比野生型提高了0.7%-11.0%。