卵巢恶性肿瘤因其发病部位隐匿、发病机制复杂,很难做到早期诊断及早期治疗,因而其死亡率一直居于妇科恶性肿瘤的第一位,严重威胁妇女健康。卵巢恶性肿瘤的种类较多,但其中以卵巢上皮性癌(卵巢癌)较多见,且危害较大。近一百多年来,许多学者对卵巢癌的发生、发展过程进行了全方位、系统的研究,取得了很大的进展,但是对卵巢癌的发生及发病机制的研究结果以及卵巢癌的综合治疗效果还远远不能让患者满意,因此进一步的了解并明确卵巢癌的生物学行为的变化及其可能的相关机制,为卵巢癌患者寻找更有效的治疗方法成为近年来妇科肿瘤研究者努力奋斗的目标。随着肿瘤干细胞的发现及肿瘤干细胞理论的不断丰富,妇科肿瘤研究者们开始从新的角度认识卵巢癌的的发生、发展过程。本课题组以人H08910细胞(人卵巢低分化浆液性囊腺癌细胞株)为筛选对象,采用无血清培养基培养法(培养过程中同时采用紫杉醇逐步筛选法),并通过体外实验及裸鼠体内实验成功的筛选出具有CD133+、CD117+阳性表达特征的卵巢癌干细胞,并对其相关的干细胞标志基因及生物学特性进行了初步鉴定,为进一步研究卵巢癌干细胞生物学行为及相关机制奠定了基础。近年来,基因治疗作为卵巢癌的生物治疗的方法之一,显示出了强大的生命力,自从2000年由Bednarek应用鸟枪基因测序技术分离并鉴定出WWOX基因(抑癌基因)以来,WWOX基因在卵巢癌发生、发展过程中的作用越来越受到人们的重视。基于以上因素,在本研究中,我们以前期筛选出的卵巢癌干细胞为研究基础,进一步研究WWOX基因对卵巢癌干细胞生物学行为的影响及其可能的机制,期望为卵巢癌的生物治疗寻找新的靶点。本研究分以下四部分进行：第一部分：WWOX基因干预对人卵巢癌干细胞生物学特性的影响第二部分：WWOX基因干预对人卵巢癌干细胞增殖及细胞周期的影响第三部分：WWWOX;基因干预对人卵巢癌干细胞凋亡及侵袭能力的影响第四部分：WWOX基因干预对人卵巢癌干细胞体内致瘤能力的影响第一部分：WWOX基因干预对人卵巢癌干细胞生物学特性的影响研究背景：WWOX基因是2000年由Bednarek应用鸟枪基因测序技术(shot gun sequencing)分离并鉴定出的一个抑癌基因。我们的前期研究已经证实WWOX基因对人H08910细胞的生物学行为具有明显的影响。肿瘤干细胞学说认为,肿瘤组织中只有少量的肿瘤细胞具有类似干细胞的特性,能够进行自我更新和分化,从而产生具有不同致瘤能力的异质性细胞群体,这类细胞群体对化疗药物具有明显的耐受性,是肿瘤耐药和复发的根源,这类细胞被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞研究是目前肿瘤研究的热点问题之一,而肿瘤干细胞的分离及鉴定是肿瘤干细胞研究的基础。本课题组以人H08910细胞为筛选对象,采用无血清培养基结合紫杉醇培养法筛选出具有CD133+、CD117+日性表达特征的卵巢癌干细胞,并对其相关的干细胞标志物进行了初步鉴定。在此基础上,我们提出以下科学疑问：1.我们分离出的卵巢癌干细胞是否具有肿瘤干细胞的生物学特性?2WWOX基因对卵巢癌干细胞的生物学特性有无影响?研究目的：1.对前期筛选的卵巢癌细胞系H08910来源的干细胞的生物学特性进行鉴定。2.研究抑癌基因WWOX对人卵巢癌干细胞生物学特性的影响。研究方法：1.取前期冻存保留的卵巢癌干细胞球体,体外复苏,采用球体形成实验观察卵巢癌干细胞体外连续球体形成能力。2.将pcDNA3.1-WWOX真核表达载体体外转染至卵巢癌干细胞(WWOX基因组),筛选能够稳定转染的卵巢癌干细胞并进一步扩增及培养。采用RT-PCR方法检钡WWOXmRNA的表达情况,同时以转染pcDNA3.1空质粒(pcDNA3.1组1及未转染的卵巢癌干细胞(对照组)作为对照。3.将三组干细胞分别制成单细胞悬液观察其自我更新能力的变化。4.将三组干细胞分别接种于含血清培养基观察其分化能力的变化并对分化前后相关的干细胞标志基因进行检测。5.采用药敏实验检测三组干细胞对顺铂、多柔比星及米托蒽醌的敏感性。6.将三组干细胞分别接种于NOD/SCID小鼠,观察其体内成瘤性的变化。研究结果：1.卵巢癌干细胞在无血清培养基培养条件下能形成可稳定传代的细胞球体。2. RT-PCR检测结果表明,WWOXmRNA在WWOX基因组干细胞中呈高表达,而pcDNA3.1组及对照组干细胞未检测到WWOXmRNA的表达。3.pcDNA3.1组及对照组干细胞具有较强的自我更新能力,WWOX基因组干细胞的自我更新能力明显降低。4. pcDNA3.1组及对照组干细胞具有较强的分化能力,WWOX基因组干细胞的分化能力明显降低。分化前WWOX基因组干细胞的CD133+、CD117+、 ABCG2、Nanog、Oct4及BCRP等干细胞标志物的表达水平显著低于分化前pcDNA3.1组及分化前对照组干细胞,而分化前WWOX基因组干细胞的分化潜能标志物E-cadherin的表达水平显著高于分化前pcDNA3.1组及分化前对照组干细胞。5.pcDNA3.1组及对照组干细胞对顺铂、多柔比星及米托蒽醌具有较强的耐药性,WWOX基因组干细胞对顺铂、多柔比星及米托蒽醌的耐药性明显低于pcDNA3.1组及对照组干细胞。6. pcDNA3.1组及对照组干细胞在体内具有很强的成瘤能力,WWOX基因组干细胞的致瘤能力明显低于pcDNA3.1组及对照组干细胞。研究结论：1.来自人卵巢癌细胞系H08910的卵巢癌干细胞具有自我更新和分化能力、体内成瘤能力、高表达干细胞基因以及多药耐药等肿瘤干细胞特性。2.抑癌基因WWOX转染后在卵巢癌干细胞中能够稳定的表达。3.抑癌基因WWOX对卵巢癌干细胞的自我更新和分化能力、体内成瘤能力、高表达干细胞基因以及多药耐药等肿瘤干细胞的生物学特性具有明显的影响。第二部分：wwox基因干预对人卵巢癌干细胞增殖及细胞周期的影响研究背景：肿瘤干细胞学说的提出对恶性肿瘤的病因及发病机制进行了全新的解释,为以后的卵巢癌的病因学研究提供了新的思路。我们在既往的研究中发现,抑癌基因wwox可干扰卵巢癌细胞的细胞周期并抑制其生长增殖。那么,在前期研究基础上,我们有理由提出以下科学疑问：wwox基因对人卵巢癌干细胞的增殖及细胞周期有无影响?如果有,那么其机制是什么?关于这一科学问题,目前,国内外未见报道。因此,在本研究中,我们将wwox基因转染至人卵巢癌干细胞,观察wwox基因对人卵巢癌干细胞增殖及细胞周期的影响,并探讨其可能的机制。研究目的：1.探讨wwox基因对人卵巢癌干细胞增殖情况的影响。2.探讨wwox基因对人卵巢癌干细胞周期的影响及可能机制。研究方法：细胞分组方法同第一部分1.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测三组干细胞的增殖情况。2.采用软琼脂克隆形成实验检测三组干细胞的克隆形成能力的变化。3.采用流式细胞仪检测三组干细胞的细胞周期的变化。4.采用Western blot方法检测三组干细胞的p21、p27、 Cyclin E-CDK2、Cyclin D-CDK4等表达情况的变化。研究结果：1. WWOX基因组干细胞在每个时间点的细胞增殖能力与pcDNA3.1组及对照组干细胞比较均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。2. WWOX基因组干细胞的琼脂克隆形成率为35.6%,明显低于pcDNA3.1组(68.1%)及对照组干细胞(72.0%),差异均有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞仪分析结果表明,WWOX基因组干细胞G0/G1期的比例明显升高,S期细胞比例明显减少,分别与pcDNA3.1组及对照组干细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而pcDNA3.1组与对照组比较,差异则无统计学意义(P>0.05)。4. Western blot检测结果显示,WWOX基因组干细胞中p21蛋白和p27蛋白的表达水平(分别为0.57±0.023,0.54±0.028)较pcDNA3.1组及对照组干细胞均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。WWOX基因组干细胞的Cyclin E、CDK2的表达水平(分别为0.19±0.038；0.21±0.017)较pcDNA3.1组与对照组干细胞均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。WWOX基因组干细胞的CyclinD、CDK4表达水平(分别为0.28±0.011；0.31±0.062)较pcDNA3.1组与对照组干细胞均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.WWOX基因对卵巢癌干细胞的增殖能力具有明显的抑制作用。2. WWOX基因通过p21蛋白及p27蛋白的表达上调进而干扰卵巢癌干细胞的细胞周期且WWOX基因可能通过调节CyclinE-CDK2和CyclinD-CDK4的活性而发挥对卵巢癌干细胞的细胞周期的负向调节作用。第三部分：wwox基因干预对人卵巢癌干细胞凋亡及侵袭能力的影响研究背景：既往的研究显示,wwox基因可能通过Caspase-3途径促进HO8910细胞的凋亡,那么,WWOX基因对人卵巢癌干细胞的凋亡有无明显影响?如果有,其可能的机制是什么?具有极强的侵袭性和转移性是卵巢癌干细胞的特征之一,我们在筛选人卵巢癌干细胞的实验中亦发现卵巢癌干细胞的侵袭能力较普通H08910细胞明显增强。关于卵巢癌干细胞侵袭性的形成机制,主要集中在上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions, EMT)的研究上,由此我们提出以下科学假设：WWOX基因对人卵巢癌干细胞的侵袭能力及EMT有无影响?如果有,其可能的机制是什么?研究目的：1.探讨WWOX基因对人卵巢癌干细胞凋亡率的影响及其可能机制。2.探讨WWOX基因对人卵巢癌干细胞侵袭能力的影响。3.探讨WWOX基因对人卵巢癌干细胞EMT的影响及其可能机制。研究方法：细胞分组方法同第一部分1.采用流式细胞仪检测三组干细胞的凋亡率的变化,采用Western blot方法检测三组干细胞的Caspase-3、JNK、ERK及P38表达情况的变化。2.采用侵袭小室(Traswell)实验检测三组干细胞的侵袭能力的变化。3.首先以未转染wwox基因的卵巢癌干细胞及普通H08910细胞为研究对象,采用Western blot方法检测卵巢癌干细胞及普通H08910细胞的EMT标志物(E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin及Fibronectin)表达情况的变化；其次再采用Western blot方法分别检测三组干细胞的EMT标志物(E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin及Fibronectin)的变化以及EMT调控因子Elf5及Snail的表达情况的变化。研究结果：1.WWOX基因组干细胞的凋亡率为：(39.26+0.47)%,与pcDNA3.1组与对照组干细胞比较均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05). Western blot检测结果显示,WWOX基因组干细胞的Caspase-3、JNK、ERK及P38的表达水平较pcDNA3.1组与对照组干细胞均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。2. Traswell侵袭实验结果显示,WWOX基因组干细胞的穿膜细胞数为(105.5±3.1)个,分别与pcDNA3.1组的(199.7±3.4)个及对照组的(191.4±4.1)个比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.1组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)3.Western blot检测结果显示,卵巢癌干细胞组E-cadherin、β-catenin的表达水平较普通细胞组明显降低,而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等表达水平较普通细胞组明显增强。WWOX基因组干细胞的E-cadherin、β-catenin、Elf5表达水平分别为：0.762±0.007、0.911±0.016、0.841±0.021,与其它两组比较均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);WWOX基因组干细胞的N-cadherin、 Vimentin、Fibronectin及Snail表达水平分别为：0.212±0.008、0.136±+0.017、0.311±0.015、0.339±0.027,与其它两组比较明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.WWOX基因可能通过MAPK(JNK、ERK及P38)/caspase-3信号通路影响卵巢癌干细胞的凋亡。2. WWOX基因对卵巢癌干细胞的侵袭能力具有明显的抑制作用。3.卵巢癌干细胞存在EMT现象,WWOX基因可能通过调控转录因子Elf5及Snail的表达进而逆转卵巢癌干细胞的EMT现象,从而抑制卵巢癌干细胞的侵袭能力。第四部分：WWOX基因干预对人卵巢癌干细胞体内致瘤能力的影响研究背景：我们前面的研究表明,WWOX基因在体外对卵巢癌干细胞的增殖、凋亡、侵袭能力及干细胞特性具有明显的影响,那么WWOX基因在体内对卵巢癌干细胞的致瘤能力有无影响呢?因此,在本研究中,我们建立卵巢癌干细胞移植瘤模型以进一步观察WWOX基因在体内对卵巢癌干细胞生物学行为的影响,为卵巢癌的基因治疗提供理论基础。研究目的：探讨WWOX基因在体内对人卵巢癌干细胞致瘤能力的影响及其可能机制,寻求卵巢癌基因治疗的新途径。研究方法：细胞分组方法同第一部分1.将三组干细胞分别接种于NOD/SCID小鼠腹腔,建立卵巢癌腹腔移植瘤模型,定期观察NOD/SCID小鼠,并记录小鼠死亡日期。2.小鼠死亡后立即解剖腹腔。准确计算腹水量并观察腹腔移植瘤数目、重量、腹腔移植瘤最大直径及腹腔脏器转移情况,对转移瘤进行HE染色行病理检查以证实其致瘤性。3.采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测三组小鼠肿瘤组织的凋亡指数。4.采用免疫组织化学法检测三组小鼠肿瘤组织中的E-cadherin、Elf5及Snail的表达情况。研究结果：1. NOD/SCID小鼠体内实验表明,WWOX基因组小鼠体内的致瘤能力(包括转移灶数目、重量及移植瘤最大直径、腹水量)明显低于pcDNA3.1组及对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2. TUNEL检测结果显示,WWOX基因组肿瘤组织的凋亡指数明显高于pcDNA3.1组及对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.免疫组织化检测结果显示,WWOX基因组肿瘤组织中E-cadherin、Elf5的表达水平明显高于pcDNA3.1组及对照组,WWOX基因组肿瘤组织中Snail的表达水平明显低于pcDNA3.1组及对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.WWOX基因在体内可以抑制卵巢癌干细胞增殖、促进卵巢癌干细胞的凋亡进而使其致瘤性降低。2. WWOX基因在体内亦通过调控转录因子Elf5及Snail的表达进而抑制卵巢癌干细胞的侵袭能力。