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研究目的:胃癌是一种具有高度增殖侵袭能力的恶性肿瘤,最新的流行病学数据显示,世界范围内,胃癌的发病率位居全部恶性肿瘤的第五位,而死亡率高居第三位,而在我国,胃癌的发病率和死亡率仅次于肺癌,高居第二位。目前针对胃癌的治疗手段非常有限,早期胃癌手术治疗后预后较好,但是由于早期胃癌检出率低,大部分患者发现时均已经是中晚期,同时由于胃癌的基因组不稳定性和异质性,广谱的化疗药物和靶向治疗药物疗效较差,这一系列原因最终导致胃癌五年生存率不足20%,因此我们迫切需要找到胃癌的优势通路和靶点,延长胃癌患者生存期。在本课题组的前期研究中,我们整合分析了90例天津胃癌micro RNA和m RNA芯片表达数据,结合患者临床信息,我们绘制了一个miRNA-m RNA调控网络,在这个调控网络中,我们发现miR-125b在胃癌中高表达且与胃癌患者不良预后相关。世界范围内,女性胃癌发病率整体低于男性(平均男女比例为2:1),但在年龄小于40岁的人群中,女性胃癌发病率显著上升(男女比例为1.4:1),并且年轻女性在印戒细胞癌等多种亚型的胃癌中预后较差。性别因素在胃癌发病和预后的作用机制尚不清楚,迫切需要全面系统的研究。在本课题的前期研究中,我们整合分析了多个胃癌公共数据集,试图从基因表达差异的角度解释男女胃癌发病和预后的性别差异。前期研究结果显示,胃癌性别差异基因主要富集再X/Y染色体上,信号通路分析初步结果证实性别差异可能与雄激素受体AR有关,因此,在本研究中,我们探究miR-125b影响胃癌预后的关联,探究AR在胃癌发生发展中的作用机制,寻找胃癌潜在的治疗靶点。研究方法:第一部分中我们通过临床样本数据分析(373例胃癌样本)和实验验证,探究miR-125b在胃癌中的作用机制。我们首先通过数据分析,研究miR-125b与胃癌预后的关联及可能的作用机制:RT-q PCR检测90例胃癌和配对的癌旁miR-125b表达水平;Kaplan-Meier法分析miR-125b表达与胃癌预后的关联;胃癌组织芯片预测miR-125b潜在的靶点;基因表达谱分析,鉴定miR-125b转染的胃癌细胞中miR-125b的靶基因及其相关信号通路。然后,我们通过一系列凋亡和细胞活力实验检测miR-125b与细胞凋亡关联。MTT、流式细胞术、TUNEL分别检测miR-125b对细胞活力、早期凋亡和晚期凋亡的影响。体内实验选择裸鼠作为研究模型;皮下成瘤的方式接种瘤块,瘤内注射的方法处理实验组和对照组,定期测量瘤块大小,绘制瘤块生长曲线,检测凋亡相关指标变化。我们进一步分析miR-125b调节胃癌凋亡的分子机制,基于miRNA的作用原理,我们在Target Scan等在线网站预测miR-125b靶基因,通过Luciferase、q PCR和WB检测miR-125b对靶基因的调节作用,进一步分析miR-125b靶基因与胃癌患者预后的关联,阐明miR-125b介导胃癌预后不良的分子机制。第二部分中我们通过关联分析、机制研究和转化研究三个阶段探究AR/miR-125b通路在胃癌预后和靶向治疗中的作用及分子机制。关联分析部分我们首先对多个胃癌数据集的性别差异基因进行整合分析,进而对差异基因进行通路分析,找到性别差异在胃癌中的关键通路;进一步我们通过聚类分析和实验验证,证实AR和miR-125b表达的关联。机制研究部分我们通过生物信息学预测、EMSA、Ch IP、Luciferase等一系列转录调控相关研究方法检测AR对miR-125b的转录激活作用。转化研究部分我们通过一系列凋亡和细胞活力检测抗雄激素治疗在AR阳性胃癌中的潜在治疗作用,MTT、流式细胞术、TUNEL分别检测抗雄激素治疗对AR阳性胃癌细胞活力、早期凋亡和晚期凋亡的影响;WB检测比卡鲁胺对凋亡通路的关键蛋白的调节作用。体内动物实验分为雌鼠组和雄鼠组,以模拟男女胃癌患者对抗雄激素治疗的敏感性差异,体内实验选择裸鼠作为研究模型,皮下二次成瘤的方式接种瘤块,灌胃给药的方法处理实验组和对照组,定期测量瘤块大小,绘制瘤块生长曲线,检测凋亡相关指标变化。研究结果:第一部分miR-125b促进胃癌恶性进展及其分子机制研究的研究结果:q PCR检测90例胃癌标本miR-125b的表达,结果显示与癌旁相比,miR-125b在肿瘤组织表达显著上调;单因素和多因素分析发现miR-125b与预后不良相关(P=0.011);信号通路分析表明与miR-125b表达负相关的178个基因主要参与细胞凋亡/程序性死亡途径。细胞实验(MTT、流式细胞术、TUNEL)证实,miR-125b增强细胞活力,抑制细胞凋亡;通过皮下接种胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803,建立了裸鼠胃癌移植瘤模型,体内实验证实与对照组相比,miR-125b组的肿瘤生长较快。Luciferase、q PCR和WB等实验证实凋亡基因BIK和CASP6为miR-125b的靶点;胃癌中BIK(P=0.048)和CASP6(P=0.34)高表达患者生存期长。第二部分AR/miR-125b通路可作为女性胃癌预后和靶向治疗的分子标志物研究。在关联分析部分:人工智能算法整合分析来自四个数据库(天津、TGCA、GEO和ACRG)中五个数据集的男女性别差异基因,结果显示差异基因主要富集X/Y染色体上;根据男女性别基因表达差异对天津数据集和TCGA数据集中的差异基因进行信号通路分析,结果显示,差异基因主要通路中的X染色体失活逃逸、前列腺癌相关通路和激素合成代谢通路均与AR相关;90例胃癌AR高低表达与miRNA表达的聚类分析结果证实AR与miR-125b表达正相关,扩大样本的天津数据集和TCGA数据集均能验证此结论。机制研究部分:生物信息学预测结果显示miR-125b两个转录本(miR-125b1和miR-125b2)启动子区含有四个雄激素受体应答元件(ARE);Ch IP、EMSA和Luciferase实验证实AR可以转录激活miR-125b,且转录激活作用受雄激素调控;生存分析结果显示AR高表达的患者生存期较短,且女性患者预后与AR表达之间存在显着相关性,对AR和miR-125b表达合并分析结果显示AR和miR-125b均高表达组与胃癌病例的预后较差显著相关。转化研究部分:细胞实验(MTT、流式细胞术、TUNEL)证实,抗雄激素治疗抑制AR阳性胃癌细胞活力,促进细胞凋亡;动物移植瘤模型实验证实,比卡鲁胺可以显著抑制雌性小鼠的移植瘤的生长,促进坏死和凋亡,但在雄性小鼠中,比卡鲁胺仅抑制了AR高表达胃癌移植瘤的生长,对AR低表达胃癌移植瘤生长无抑制作用。研究结论:miR-125b通过靶向促凋亡基因Casp6和BIK,抑制胃癌细胞凋亡相关信号通路,起促癌作用,进而导致女性胃癌患者预后不良;胃癌中AR可以转录激活miR-125b启动子区活性,促进miR-125b表达上调;使用抗雄激素治疗阻断AR/miR-125b信号通路,能够显著抑制miR-125b表达,诱导胃癌细胞凋亡,可作为AR阳性胃癌患者靶向治疗的手段。