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油茶是我国极具食用价值和经济价值的木本油料树种。油茶属自交不亲和树种,种植时需要进行合理的品种配置。为解析油茶自交不亲和的分子机制,本实验室团队以油茶主要栽培品种‘华鑫’和‘华金’为试验材料,构建了自交和异交授粉后存在显著差异的雌蕊转录组数据库。通过转录组解析,发现ABC转运蛋白代谢途径与油茶自交不亲和紧密相关,为此,本课题开展了油茶ABC转运蛋白的基因克隆及功能研究。取得如下研究结果:1.油茶6条ABC转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析。从油茶自交和异交雌蕊转录组数据中筛选得到6条差异显著的ABC转运蛋白基因,设计6对特异性引物,扩增并克隆获得具有全长的CDS基因序列;该6个基因的全长CDS序列分别为:3381 bp、2142 bp、2172 bp、1935 bp、2166 bp、3318 bp,分别编码 1126、713、2172、644、721、1105 个氨基酸;相对分子量分别为 126.53、79.63、79.93、72.65、80.47、121.84kDa;等电点 PI 分别是 9.02、5.8、8.84、7.91、80.47、8.9;预测结果显示分别含有13、0、6、6、6、5个跨膜结构。保守结构域分析发现6个基因均含有NBD结构域,包括Walker A基序,ABC标签序列和Walker B基序三个特征序列,确认属于ABC转运蛋白家族。对上述6个基因分别命名为:CoABCC9、CoABCF3、CoABCG3、CoABCG5、CoABCG11、CoABCG28。2.揭示了油茶6个ABC转运基因在不同组织部位和不同时段的表达规律。试验结果表明,各基因在不同组织部位存在明显的表达差异,CoABCC9和CoABCF3基因在老茎和花粉中表达较高,CoABCG3和CoABCG5基因在老茎和芽中表达量较高,CoABCG11基因在花瓣中表达较高,CoABCG28基因在花粉中特异表达。各基因在不同授粉时期的花柱和子房也存在显著的表达差异,CoABCC9、CoABCF3、CoABCG3、CoABCG28基因在授粉 24 或 36 h 时,自交花柱的表达量均高于同时段的异交和未授粉的表达量;CoABCC9、CoABCG3、CoABCG11、CoABCG28基因在36或48 h时,自交子房的表达量均大于同时段的异交和未授粉的表达量。说明这些基因在不同部位和不同时段差异显著,可能参与自交不亲和反应。3.在CoABCF3基因序列克隆的基础上,构建了原核表达载体Pcold-TF-CoABCF3。将其转化至大肠杆菌Ecoli(DE3)表达载体中,成功诱导出蛋白分子量为79.93 kDa的目的蛋白。4.成功构建了 6个基因的亚细胞定位表达载体。观察结果显示:CoABCC9、CoABCG11、CoABCG28基因在细胞膜和叶绿体上均有分布,CoABCG3和CoABCG5基因主要分布在细胞膜上,CoABCF3基因主要分布在线粒体上。5.构建了 CoABCC9、CoABCF3、CoABCG3、CoABCG5、CoABCG11、CoABCG28基因的超表达载体,通过花粉管通道法转化至拟南芥中,成功获得T2代阳性植株。表型观察结果显示:CoABCC9基因超表达植株的根系生长显著长于野生型植株的根系,转基因叶片生长相比野生型拟南芥更为旺盛;CoABCG3基因超表达植株所结果实显著短于野生型拟南芥植株的果实;其他四条基因超表达植株的表型无明显差异。6.采集T2代CoABCC9、CoABCF3、CoABCG28基因超表达植株的花蕾作为实验材料,测定了可溶性糖含量。分析结果显示:CoABCC9基因超表达植株的可溶性糖含量显著高于野生型拟南芥;CoABCF3基因超表达植株的可溶性糖含量显著低于野生型拟南芥;CoABCG28基因超表达植株的可溶性糖含量低于野生型拟南芥。