番茄中miR397靶基因LeLAC<'miR397>的克隆与表达分析

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LAC(EC1.10.3.2)/漆酶是一类含铜的糖蛋白(多酚氧化酶),存在于植物、真菌、昆虫和细菌等多种有机体中,在木质素合成、离子吸收和逆境响应等方面具有重要功能,并在转录后水平受多种microRNA的调控。 本研究在GenBank进行BLAST分析,获得了15个番茄LAC基因相关的EST片段,并对这些EST进行了同源比较和序列拼接,得到一个含有小分子RNAmiR397识别位点的LAC基因片段。然后,根据该片段的核苷酸序列信息进行5-和3-RACE扩增,得到了番茄LAC基因的全长cDNA(LeLACmiR397,登录号EU503151)。 氨基酸序列分析表明,LeLACmiR397蛋白与南芥AtLAC7和豌豆PsLAC同源性最高。蛋白质结构域推测表明,LeLACmiR397蛋白存在一个Cu-氧化酶结构域。LeLACmiR397基因的时空表达分析表明,该基因在根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达,而在叶和茎中不表达。 鉴于小分子RNA miR397在不同植物中是高度保守的,为了检测miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控,以拟南芥基因组DNA为模板,克隆了miR397α基因的前体序列,并构建了miR397α的表达载体,用农杆菌侵染法转化番茄子叶,获得了转基因番茄植株。表达分析表明,LeLACmiR397基因在非转基因番茄的成熟果实和根中表达,但在转基因番茄的果实和根中检测不到LeLACmiR397基因表达,所以,LeLACmiR397基因可能受miR397α的转录后调控,发生基因沉默。 LeLACmiR397基因编码多酚氧化酶,转基因番茄中多酚氧化酶活性分析表明,转基因植株的多酚氧化酶活性低于非转基因植株。盐胁迫下转基因番茄酶活性分析表明,转基因植株中三种抗性相关酶(超氧化物歧化酶SOD、多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD)的活性均低于非转基因植株,表明miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控是植物抗逆性形成的负调控因素。
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