论文部分内容阅读
目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因过量摄入酒精引发的中毒性肝脏病变,早期通常表现为酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)可进展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化(alcohol liver fibrosis,ALF)、肝硬化、甚至肝癌。ALF病因明确,但其发病机制尚未完全清楚。目前认为肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)增殖与活化是肝纤维化发生的核心环节。近十多年来国内外研究表明,缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)作为低氧应答调控的管家基因,可能通过其调节的靶基因参与HSCs的活化与增殖。HIF-1是由调节亚基HIF-1α与结构性亚基HIF-1β共同组成的异源二聚体,HIF-1α对HIF-1发挥转录因子活性起着至关重要的影响,在细胞内水平受到氧依赖和非氧依赖信号事件的调控。有研究者用内毒素培育人肝星状细胞系,发现HIF-1α高表达,且标志HSCs活化的I型胶原蛋白(Collagen I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)高表达,抑制HIF-1α表达后,I型胶原蛋白及α-SMA表达也随之减低。我们前期在酒精灌胃构建的大鼠ALD模型中观察到:随着造模时间的延长,肝组织HIF-1αmRNA和蛋白表达随之增多,提示HIF-1α可能参与着ALD发病过程。本研究选用200μmol/L乙醛刺激大鼠HSC-T6细胞,特异性抑制HIF-1α表达,观察HSC-T6细胞增殖情况及α-SMA和Collagen I表达变化。旨在细胞水平阐明抑制HIF-1α表达对HSC-T6细胞增殖及α-SMA和Collagen I表达影响,探讨HIF-1α调控的HSCs在ALF中的作用。方法:复苏HSC-T6细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5%CO2,37℃条件下培养到对数生长期。实验分为正常对照组(常规培养)、乙醛刺激组(终浓度为200μmol/L)、HIF-1αsiRNA组(si RNA100nm/L+乙醛终浓度为200μmol/L)、HIF-1αsiRNA阴性对照(negative control,NC)组(NC siRNA+乙醛终浓度为200μmol/L)。利用200μmol/L乙醛刺激大鼠HSC-T6细胞,将HIF-1αsi RNA、NC siRNA通过脂质体lipofectaminetm2000瞬时转染至hsc-t6细胞,培养6h后,更换为新鲜完全培养液继续培养48h,应用cck-8检测大鼠hsc-t6细胞增殖变化;收集细胞,分别利用rt-qpcr和westernblot法检测hif-1α、α-sma和collagenimrna和蛋白表达水平;用4%多聚甲醛固定,行免疫荧光染色,观察α-sma蛋白表达情况。结果:1转染hif-1αsirna敲低hif-1α基因对大鼠hsc-t6细胞增殖的影响瞬时转染hif-1αsirna48h后,细胞增长情况明显减慢,cck-8比色结果:与正常对照组比较,乙醛刺激组od值明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01),提示200μmol/l乙醛可明显促进hsc-t6细胞增殖;hif-1αsirna组od值与乙醛刺激组比较,细胞增长情况明显减慢,且差异具有统计学意义(p<0.01);hif-1αsirnanc组与乙醛刺激组比较,od值差异无统计学意义(p均>0.05)。2采用rt-qpcr法检测hif-1α、α-sma和collagenⅠ基因相对于β-action内参基因表达变化:正常对照组hsc-t6细胞中hif-1α、α-sma和collagenⅠ的表达均较少;乙醛刺激组与正常对照组比较,hif-1α、α-sma和collagenⅠ表达量明显增多(p均<0.01);敲低hif-1α基因,hif-1αsirna组与乙醛刺激组比较,hif-1α表达降低的同时α-sma和collagenⅠ表达明显减少(p均<0.01);hif-1αsirnanc组和乙醛刺激组比较,各个指标表达的变化,差异均无统计学意义(p均>0.05)。3通过westernblot法检测hif-1αsirna转染后hsc-t6细胞中的hif-1α、α-sma和collagenⅠ蛋白水平表达变化:乙醛刺激组hif-1α、α-sma和collagenⅠ蛋白表达量明显增多,乙醛刺激组与正常对照组比较差异有统计学意义(p均<0.01);转染hif-1αsirna48h后,hif-1α蛋白表达降低,与乙醛刺激组比较差异具有统计学意义(p<0.01),且α-sma和collagenⅠ蛋白的表达量也减低;hif-1αsirnanc组与乙醛刺激组比较,各个指标表达变化,差异均无统计学意义(p均>0.05)。4免疫荧光染色法观察大鼠hsc-t6细胞中α-sma蛋白表达情况:可观察到正常对照组细胞表达少量α-sma;乙醛刺激组细胞α-sma蛋白表达增多;转染hif-1αsirna48h后,细胞中的α-sma蛋白表达减少。结论:乙醛能够促进肝星状细胞增殖活化,敲低HIF-1α对肝星状细胞的增殖活化有抑制作用,可能是酒精性肝纤维化的潜在治疗靶点。