研究背景和研究目地人原发性中枢神经系统肿瘤发病率约2-5/10万；并且这些肿瘤中,85%为颅内肿瘤,15%为椎管内肿瘤。颅内肿瘤以胶质瘤最为多见(约占40％),其次为脑膜瘤(13％～19%),听神经瘤(神经鞘瘤)(8%～90％)。胶质瘤中,恶性星形胶质细胞瘤(胶质母细胞瘤)占50%～60%,良悱星形胶质细胞瘤约占25%～30%。儿童的颅内肿瘤发病率甚高,仅次于白血病而占小儿恶性肿瘤的第2位；儿童颅内肿瘤除胶质瘤外,髓母细胞瘤最常见。神经系统肿瘤的主要症状：①肿瘤压迫或破坏周围脑组织所引起的局部神经症状,如癫痫、瘫痪、视野缺损等。②颅内占位病变引起颅内压增高的症状,表现为头痛、呕吐、视神经乳头水肿等。nestin是一种中间丝类型的蛋白,能够特异性的表达在神经上皮干细胞上,为神经干细胞的特征性标志物之nestin-GFP转基因报告小鼠是一种最常用的研究神经干细胞的一种工具鼠,该GFP基因插入在nestin启动子下游,受nestin基因的调控,应用nestin-GFP转基因报告小鼠可以标记和示踪神经干细胞的分化和迁移。目前对于神经系统肿瘤的研究已经有了很大的进展,但是对于神经系统肿瘤的早期细胞起源和分子发生机制并不明确。大部分神经系统肿瘤在早期由于不能被及时发现,很难获得肿瘤早期的标本。当患者出现较明显的临床症状时,疾病大都已经发展到中晚期阶段,此时的细胞类型和分子标记已经发生了较大的变化,因此其相应研究只是一种回顾性研究,并不能如实反映神经系统肿瘤的早期变化。Nestin阳性报告小鼠神经系统肿瘤模型的建立将为研究神经系统肿瘤的早期细胞起源和分子发生机制提供重要的工具,其可能的应用如下：(1)揭示神经系统肿瘤的早期细胞起源及分子发生机制：(2)利用脑内神经干细胞位置的相对局限性和与神经系统肿瘤存在的异位性来研究神经系统肿瘤干细胞的来源,阐明神经系统肿瘤发生的可能机制；(3)研究神经系统肿瘤干细胞的来源和神经系统肿瘤的转化靶点不仅对神经系统肿瘤的发病机制具有重要意义,而且对神经系统肿瘤的治疗策略亦具有指导意义,即室管膜下层残存的肿瘤干细胞是新的治疗靶点：(4)研究室管膜下层肿瘤干细胞远处迁移能力,探索神经系统肿瘤的转移机制。我们的研究包含以下几个部分：首先我们对nestin-GFP转基因报告小鼠的特征进行了形态学观察；在此基础上,我们应用ENU化学诱导nestin-GFP转基因报告小鼠,试图建立nestin阳性报告小鼠神经系统肿瘤模型,并对其进行形态学的观察；最后,我们探讨其他方式建立nestin阳性报告小鼠神经系统肿瘤模型的建立方法及初步的研究。方法1.nestin-GFP转基因报告小鼠的形态学观察(1)应用整体荧光成像观察nestin-GFP转基因报告小鼠在胚胎时期和出生后nestin的表达及动态变化；(2)应用免疫组化和免疫荧光观察成年nestin-GFP转基因报告小鼠脑的nestin的定位和表达。2.ENU化学诱导nestin-GFP转基因报告小鼠后形态学观察(1)胎盘诱导取奸娠末期nestin-GFP转基因报告小鼠19只,按8个剂量：50mg/kg、83mg/kg、167mg/kg、200mg/kg、233mg/kg、250mg/kg、267mg/kg、300mg/kg经腹腔内次性注射1%ENU溶液,子代小鼠出生三周后与母鼠分开,雌雄分笼单独喂养。仔细观察子代小鼠的临床症状,包括睡眠、食欲、步态、体温、精神、体重、毛发的色泽等。(2)直接诱导取成年nestin-GFP转基因报告小鼠13只,按200mg/kg一次性腹腔注射1%ENU溶液,雌雄分笼单独喂养。仔细观察诱导小鼠的临床症状,包括睡眠、食欲、步态、体温、精神、体重、毛发的色泽等。解剖出现症状和频临死亡的二种方法诱导得到的小鼠,所有标本经固定、脱水、石蜡包埋后切片,行HE染色,光镜下判断肿瘤生长情况。3. nestin阳性小鼠髓母细胞瘤模型的建立及初步研究(1) nestin-GFP转基因报告小鼠和Ptch杂合子小鼠(Ptch-/+)杂交,获得nestin阳性Ptch杂合子小鼠(nestin-GFP-/+/Ptch-/+);(2)提取子代小鼠的DNA后,行PCR,然后琼脂糖凝胶电泳,对小鼠基因进行鉴定；(3) nestin阳性Ptch杂合子小鼠成瘤后,对成瘤小鼠的脑进行肉眼大体和整体荧光成像的观察：(4) nestin阳性Ptch杂合子小鼠(nestin-GFP-/+/Ptch-/+)成瘤后,对成瘤小鼠的脑组织进行组织病理学观察；(5) nestin阳性报告小鼠髓母细胞瘤模型发生、发展不同阶段的脑组织的组织学动态观察。结果1.在整体荧光成像下观察nestin-GFP转基因报告小鼠,发现：(1)大脑、小脑及嗅球在三周前nestin均有表达,并且各个部分之间表达强度没有明显差异；在三周后大脑和小脑表达均明显减弱；而嗅球在不同的发育阶段nestin均明显表达,与不同的发育阶段无关。(2)小鼠胰腺中nestin的表达较强且较恒定,与不同的发育阶段无关。2.免疫组化和免疫荧光结果表明,大部分nesting日性细胞位于脑室周围室管膜细胞的胞浆,并且呈强阳性表达；部分nestin日性细胞在大脑皮质、大脑髓质、海马及小脑有散在表达。3.取妊娠末期nestin-GFP转基因报告小鼠19只,按8个剂量经腹腔内一次性注射1%ENU溶液,共产出110只子代小鼠,具体病变如下：(1)肺腺瘤22例,平均成瘤时间约为11个月；肺腺癌24例,平均成瘤时间约为11个月；淋巴瘤5例(伯基特样淋巴瘤2例,弥漫大B细胞样淋巴瘤3例),平均成瘤时间约为7个月；卵巢肿瘤1例,成瘤时间约为14个月；大脑海绵状血管瘤1例,成瘤时间约为8个月。(2)按50mg/kg胎盘诱导9只子代小鼠,有2只子代小鼠成瘤,成瘤率为22.2%；83mg/kg剂量胎盘诱导时生出子代小鼠26只,有6只子代小鼠成瘤,成瘤率为23.1%；167mg/kg胎盘诱导17只,有6只小鼠成瘤,成瘤率为35.3%；200mg/kg胎盘诱导18只,有7只小鼠成瘤,成瘤率为38.9%;233mg/kg眙盘诱导17只,有12只小鼠成瘤,成瘤率为70.6%；250mg/kg胎盘诱导7只,有6只小鼠成瘤,成瘤率为85.7%；267mg/kg胎盘诱导8只,有7只小鼠成瘤,成瘤率为87.5%；300mg/kg胎盘诱导8只,有7只小鼠成瘤,成瘤率为87.5%剂量和成瘤率的差异具有显著统计学意义,剂量越高成瘤率越高(χ2=25.300,P<0.001)4.使用200mg/kg剂量的ENU直接诱导成年nestin-GFP转基因报告小鼠13只,有6只小鼠成瘤,均为胸腺淋巴瘤,平均成瘤时间约为6个月,成瘤率为46.2%。5.ENU经胎盘诱导nestin-GFP转基因报告小鼠110只,有53只小鼠成瘤,成瘤率为48.2%；使用200mg/kg剂量的ENU直接诱导成年nestin-GFP转基因报告小鼠13只,成瘤的小鼠有6只,成瘤率为46.2%。直接诱导和经胎盘诱导成瘤率的差异不具有统计学意义(χ2=0.019,P=0.890)。6.通过Ptch杂合子小鼠与nestin-GFP转基因报告小鼠杂交获得nestin阳性Ptch杂合子小鼠(nestin-GFP-/+/Ptch-/+),大约10个月之后,小鼠出现髓母细胞瘤样改变,瘤组织nestin呈强阳性表达,组织病理学证实nestir阳性Ptch杂合子小鼠可发展成髓母细胞瘤,在髓母细胞瘤形成的早期我们观察到nestin阳性Ptch杂合子小鼠的小脑外颗粒层细胞明显增生。7. nestin泪性报告小鼠的髓母细胞瘤模型不同阶段形态学动态观察,发现髓母细胞瘤形成的初期小鼠模型侧脑室的一侧细胞明显增生并且侧脑室处增生的细胞有较强的nestin表达,在髓母细胞瘤形成的中期小鼠模型的小脑外颗粒层细胞明显增生并且增生的外颗粒层细胞有较强的nestin表达,在成瘤后观察到肿瘤细胞有较强的nestin表达。结论1.nestin-GFP转基因报告小鼠脑内nestin阳性的细胞的大部分位于脑室室管膜下层(SVZ),少部分散在分布于脑的其他部位,与神经干细胞的定位和分布一致,所以nestin-GFP转基因报告小鼠可以很好地应用于神经干细胞的示踪和分析。2.ENU化学诱导nestin-GFP转基因报告小鼠可诱导小鼠肺腺瘤、肺腺癌、淋巴瘤、脑海绵状血管瘤、卵巢肿瘤,但是不能诱导神经系统肿瘤。3.应用Ptch杂合子小鼠与nestin-GFP转基因报告小鼠杂交获得nestin阳性Ptch杂合子小鼠,可成功建立nestin阳性报告小鼠的髓母细胞瘤模型,为髓母细胞瘤的早期细胞起源及分子发生机制的研究提供了重要的工具鼠。4.髓母细胞瘤的细胞起源机制：可能是最初由于侧脑室神经干细胞的增生,然后导致小脑外颗粒层细胞增生,最终导致了肿瘤的产生。