【摘 要】
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目的:探讨细颗粒物（Fine Particulate Matter,PM2.5）对Raw264.7巨噬细胞自噬及炎症反应的影响及机制。方法:实验按如下分组:空白对照组、PM2.5组、雷帕霉素（Rap,自噬诱导剂）组、羟氯喹（HCQ,自噬抑制剂）组、PM2.5+HCQ组、PM2.5+TAK242[Toll样受体4（TLR4）抑制剂]组。配制不同浓度（0、25、50、75、100 mg/L）的PM2.
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目的:探讨细颗粒物（Fine Particulate Matter,PM2.5）对Raw264.7巨噬细胞自噬及炎症反应的影响及机制。方法:实验按如下分组:空白对照组、PM2.5组、雷帕霉素（Rap,自噬诱导剂）组、羟氯喹（HCQ,自噬抑制剂）组、PM2.5+HCQ组、PM2.5+TAK242[Toll样受体4（TLR4）抑制剂]组。配制不同浓度（0、25、50、75、100 mg/L）的PM2.5混悬液分别作用于Raw264.7巨噬细胞24 h,再取100 mg/L的PM2.5混悬液分别作用于Raw264.7巨噬细胞6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h,用CCK-8试剂盒检测PM2.5对巨噬细胞活性的影响。50 mg/L PM2.5作用于巨噬细胞24 h后透射电镜下观察巨噬细胞中的自噬泡、自噬小体及自噬溶酶体情况。Ad-m Cherry-GFP-LC3B自噬双标腺病毒转染巨噬细胞后在荧光显微镜下观察各组荧光表达情况进一步评估自噬通量。免疫印迹（Western Blot）法检测自噬相关蛋白,包括微管相关轻链1蛋白3比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）、p62蛋白、组织蛋白酶B（CTSB）、溶酶体膜蛋白2（LAMP2）和炎症相关蛋白:TLR4、核苷酸结合域样受体蛋白3（NLRP3）的表达水平;酶联免疫吸附法（ELISA）检测相关炎症因子:白细胞介素（IL）-1β、IL-18、IL-10分泌水平。结果:CCK-8检测结果显示Raw264.7巨噬细胞活性随着PM2.5浓度的增加和作用时间的延长而降低。与对照组相比,透射电镜下PM2.5组可见较多自噬空泡及双膜自噬小体,但自噬溶酶体少见;而荧光显微镜下PM2.5组黄色荧光与红色荧光比值高于对照组和Rap组（P＜0.05）。相较于空白对照组,PM2.5组NLRP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB、IL-1β、IL-18的表达上调（P＜0.05）,LAMP2、IL-10表达下调（P＜0.05）;而HCQ抑制自噬的同时,促进NLRP3、IL-1β、IL-18的表达,抑制IL-10表达（P＜0.05）。相较于对照组、PM2.5组、HCQ组,PM2.5+HCQ组NLRP3、IL-1β、IL-18的上调及IL-10下调更为显著（P＜0.05）。此外,PM2.5组TLR4表达高于对照组,TAK-242抑制TLR4后NLRP3、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、CTSB、IL-1β、IL-18的表达较PM2.5组下调,LAMP2和IL-10的表达上调（P＜0.05）。结论:PM2.5可时间和浓度依赖性地降低巨噬细胞活性;且PM2.5诱导Raw264.7巨噬细胞发生自噬,但阻断自噬通量,进而加重巨噬细胞炎症反应,且该过程可能由TLR4介导。
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