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目的:研究急性失血性休克对大鼠肝脏和作为移植肝生物学行为改变的影响,探讨休克性供体用于肝移植(livertransplantation,LT)的可行性和移植肝早期功能损害的机制,观察前列腺素E1(prostaglandinE1,PGE1)对肝移植全过程的保护作用,为临床血流动力学不稳定肝移植供体选择和围手术期移植肝功能保护提供理论依据。
方法:用“两袖套法”建立大鼠原位肝移植模型(ratorthotopiclivertransplantation,ROLT),其中A组为正常大鼠空白对照组,B组为正常大鼠供体肝移植手术对照组,C组为休克性大鼠供体肝移植实验对照组,D组为PGE1保护的休克性大鼠供体肝移植实验组,每组8只(无特别说明均指受体)。在游离C、D组供体肝脏后,经动脉插管放血,控制平均动脉压(meanarterialpressure,MAP)于40~45mmHg(5.5~6.0kPa),建立急性失血性休克模型。维持30min后,同B组以4℃乳酸钠林格氏液经动脉重力灌注,切取供肝。于4℃下修整供肝,准备肝下下腔静脉(infrahepaticvenacava,IVC)和门静脉(portalvein,PV)袖套管(cuff)。切除受体肝脏,植入供肝,IVC、PV重建采用袖套法(cufftechnique)吻合,肝上下腔静脉(superahepaticvenacava,SVC)重建采用缝合法吻合。D组围手术期输入PGE1,C组输入等量林格氏液,B组不输入任何液体。观察各移植组供肝冷保存时间、无肝期长短、移植肝再灌注情况和术后早期存活情况。取A组及B、C、D组术后6h(或濒死前)血液,检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、一氧化氮(nitricoxide,NO)、透明质酸(hyaluronicacid,HA)和血浆内皮素(endothelin,ET)水平。取各移植组供体休克30min、术后1h和6h及A组正常肝组织,做常规病理学检查、电子显微镜超微结构观察和免疫组织化学染色c-fos、c-jun、细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)、P选择素(P-seletin)、基质金属蛋白酶-2(matrixmetolloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinse-1,TIMP-1)检查。比较各组间以上检测指标有无差异。
结果:1.各组供肝冷保存时间和无肝期相近,分别为(2.0±0.5)h和(15.0±3.0)min。B、D组移植肝复流均匀,紫绀时间短(4.0±1.0)min,麻醉苏醒迅速,术后6h全部存活(8/8),成活率100%;C组移植肝复流差,再灌注极不均匀,紫绀时间长(7.0±2.0)min,术后苏醒延迟或不能完全苏醒,术后6h存活5只(5/8),成活率62.5%。
2.血液学检查D组ALT、AST、LDH、MDA、ET较C组明显降低(P<0.05),NO较C组明显升高(P<0.05),两组血清ALP、SOD、HA含量差别无统计学意义。D组各项检测结果接近或优于B组。MDA、ET水平与ALT呈正相关(相关系数r分别为0.578和0.793),NO和NO/ET值与ALT呈负相关(相关系数r分别为-0.681和-0.732)。
3.常规病理学检查C组可见肝实质片状坏死,有较多中性粒细胞浸润;B组、D组组织学改变相近,肝细胞稍肿胀,肝实质内中性粒细胞少见,偶见肝细胞点状坏死。
4.电镜超微结构观察见C组肝细胞肿胀明显,肝窦腔内微血栓形成,白细胞与内皮细胞粘附并向肝实质内浸润;D组、B组超微结构基本保持完好,白细胞少见。
5.免疫组织化学染色检查各组均见c-fos、c-jun、ICAM-1、P-selectin、MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达,但各组表达强弱、时相特点和表达细胞不同。
结论:1.重度休克大鼠肝脏应激活化,即早基因(immediateearlygenes,IEG)开始表达,引发下游多种炎性细胞因子基因级联放大式表达,对肝脏组织结构和功能造成很大损害。该过程在移植肝再灌注后进一步加重,使原发性移植肝无功能率明显升高,也使术后肝外并发症发生率增加。因此,重度休克性供体特别是未采取有效的保护性措施者,应避免用于肝移植。
2.氧自由基(oxygenfreeradical,OFR)和脂质过氧化作用(lipidperoxidation)、中性粒细胞活化浸润参与了移植肝再灌注后早期的功能损害,粘附分子、基质金属蛋白酶表达是炎细胞浸润和发挥效应的重要中介环节。对上述过程进行选择性干预,有利于维护移植肝功能。
3.肝移植受体血液NO、ET水平反映了肝窦微循环状态和肝窦内皮细胞功能,NO、ET和NO/ET比值与肝脏酶学水平有较好的相关性,与常规酶学检查相结合,可较好地判断移植肝早期功能情况,指导治疗方案选择。
4.PGE1在肝移植围手术期应用具有多方面的价值:①稳定血流动力学。②维持近于正常的NO/ET比例关系,改善微循环。③抑制中性粒细胞活化浸润,减少氧自由基的生成,抑制脂质过氧化作用,稳定质膜,发挥广泛的细胞保护作用。④抑制金属蛋白酶表达,保护肝脏间质网状支架结构。⑤改善移植肝的免疫学行为。