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研究背景在世界范围内超过3.5亿人是慢性乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)携带者。部分慢性乙肝患者(chronic hepatitis B patients, CHB)会进一步发展成终末期肝病,包括肝硬化和肝癌。肝硬化(liver cirrhosis, LC)是慢性肝病在发展过程中持续性的肝损伤-愈合反应导致而成的。肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。研究表明,病毒因素、环境因素以及宿主的遗传因素相互作用,影响HBV感染的结局。其中,宿主细胞内一些重要信号通路的异常已成为疾病发生机制的研究热点。转换生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-B)信号通路可调节多种细胞生物学过程,如细胞增殖、分化、凋亡、纤维化、肿瘤发生、血管生成以及免疫应答等。TGF-β1及其三个受体,即转化生长因子β受体I(TβRI),受体Ⅱ(TBRII),受体Ⅲ(TBRIII)在慢性乙肝发展进程中发挥着重要的作用。此外,血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)可在体内诱导血管新生,并且可以增加血管通透性,因此它在肿瘤的生长、转移过程中扮演着至关重要的角色。本研究采用病例-对照的研究方法,以TGF-β信号通路上的4个核心家族成员,即TGF-β1、TfiRⅠ、TβRIⅡ、TβRⅢ为候选基因,以探讨HBV相关疾病遗传易感性。并通过对本实验室已筛出的肝癌易感基因VEGFA,进行进一步的功能验证,将有助于寻找更为合适而有效的治疗靶点。研究方法以347例肝癌患者、243例肝硬化患者、708例慢肝患者和881例未感染过HBV且乙肝五项全阴的人群为研究对象,采用病例-对照的研究方法,利用PCR-RFLP/TaqMan的检测方法分析TGF-β1及其三个受体基因潜在功能区域上的16个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点(TGF-β1基因上的rs2317130,rs4803457, rs56719111, rs1800469和□rs1800470; TβRI基因上的rs334348,rs334349,rs3739798和rs1590；TβRⅡ基因上的rs2228048；TβRⅢ基因上的rs1805109,rs1805110,rs2810904,rs1805112,rs284878和rs1804506)与HBV相关疾病遗传易感性的关联性。并通过双荧光素酶报告基因实验、凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)以及实时荧光定量PCR实验对肝癌易感基因VEGFA启动子区SNPs影响基因转录活性进行进一步的功能验证。研究结果1.分别进行三组病例-对照研究,分析TGF-β1及其3个受体基因多态性与HBV相关疾病的关联性。1)以CHB为病例,未感染过HBV且乙肝五项全阴的人群为对照进行研究单位点分析未发现与CHB易感性相关联的SNPs。2)以LC为病例,未感染过HBV且乙肝五项全阴的人群为对照进行研究单位点分析未发现与LC易感性相关联的SNPs。3)以HCC为病例,未感染过HBV且乙肝五项全阴的人群为对照进行研究单位点分析结果显示,TβRⅢ基因上的rs1805110的T等位基因频率在病例组中显著高于对照组,二者呈现显著的统计学差异(P=0.034)。性别分层后分析结果显示,在男性中,rs1805110位点的T等位基因频率在病例组与对照组的统计学差异更为显著(P=0.005),但这种统计学差异在女性中不存在。进一步进行单倍型分析结果显示,TβRⅢ基因的5个SNPs位点组成的单倍型C-C-G-C-A在病例组中的分布频率显著低于对照组(P=0.001),而单倍型T-C-G-C-A的分布频率在病例组中显著高于对照组(P=0.036)。2.HCC发生的易感基因VEGFA的功能验证1) VEGFA基因启动子区多态性位点对启动子活性的影响已成功构建的4个表达质粒pGL3-VEGFA-启动子区域(-1661～+279bp),在瞬时转染HepG2细胞后,双荧光素酶报告基因实验检测结果显示,rs833061C-rsl570360A质粒的表达活性是rs833061T-rs1570360G表达活性的2.59倍,二者呈现显著的统计学差异(P=0.00005)。2) VEGFA基因18bp插入等位基因与转录因子结合位点EMSA实验结果表明,18bp插入等位基因产生一个与Spl转录因子结合的位点。3) VEGFA的mRNA表达水平实时荧光定量PCR实验结果显示,HCC患者VEGFA的mRNA表达水平是CHB患者的5.16倍,是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)为阴性的健康人群的6.95倍,在三者间呈现显著的统计学差异(P=1.15e-10)。研究结论1.HBV相关疾病遗传易感性的研究结果提示,在男性中,位于TβRⅢ基因上的rs1805110-T等位基因是HBV相关肝癌发生的危险因素。2.对肝癌易感基因VEGFA功能验证结果提示,EGFA启动子区的SNPs可能会通过改变启动子的活性来促进肝癌的发生。