目的IBD 包括溃疡性结肠炎(ulcerativeColitis,UC)和克罗恩病(crohn’s disease,CD)两种形式,在亚洲地区发病率逐年上升,具有慢性迁延性、复发性、非特异性、炎症性特点,病因未明,其发病机制与遗传、环境、肠道菌群、免疫等多种因素有关。由于IBD发病因素的多样性、复杂性及西药治疗的局限性,目前尚缺乏有效的治疗手段。传统中医药具有治疗慢性难治性疾病的优势,使得近年来传统中医药治疗IBD的研究越发被重视。大黄牡丹汤(rhubarb peony decoction,RPD)是东汉时期张仲景《金匮要略》中专为治疗肠痈初起而设,临床上一直沿用至今,具有泻热逐癖、消肿散结、凉血止血之功效,现代临床上,大黄牡丹汤治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),疗效显著,然而,其具体是治疗机制尚未十分清楚。研究显示,炎症性肠病患者肠道菌群紊乱,菌群代谢产物短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)减少,肠道免疫功能失调,T细胞的亚群分化失衡,其中Th17和Treg分化失衡直接参与IBD的发生。Th17和Treg是CD4+T细胞的两个亚群,前者具有免疫促进作用,其分泌的细胞因子IL-17、IL-21、IL-22等具有促炎作用;后者具有免疫抑制作用,其分泌的IL-10、TGF-β具有抑炎作用。正常情况下,机体中Th17/Treg细胞保持平衡,相互制约,相互促进,保护机体免受外来病原体的侵袭,防止疾病的发生,共同维持机体的稳态。再者,现有研究资料显示,肠道菌群及其代谢产物影响着免疫功能的发挥,具直接调控T细胞分化为Th17和Treg的作用。研究发现,大黄牡丹汤可以提高IBD小鼠外周Treg细胞数量及其比例,发挥治疗作用。那么,大黄牡丹汤治疗IBD的机制是否与其调节肠道菌群及SCFAs,从而影响Th17/Treg细胞分化相关,尚未清楚。故本研究采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的IBD小鼠模型研究大黄牡丹汤对IBD小鼠肠道菌群、SCFAs和Th17/Treg的影响,探究其治疗机制。方法1.大黄牡丹汤质量控制采用高效液相色谱法监测大黄牡丹汤的指纹图谱,比对大黄素、芦荟大黄素、大大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷、葫芦巴碱等活性成分混合的图谱进行质量控制;2.动物造模、分组及给药采用DSS诱导IBD小鼠模型,即小鼠自由饮用2.5%DSS 5天,诱导急性溃疡性结肠炎小鼠模型。设正常对照组(Control)、IBD模型组(DSS)、美沙拉嗪组(Mesalazine)和大黄牡丹汤低剂量组(RPDL)、大黄牡丹汤中剂量组(RPDM)、大黄牡丹汤高剂量组(RPDH),诱导模型的同时,灌胃给予美沙拉嗪和大黄牡丹汤治疗14天,正常对照组和模型组灌胃给予等体积的无菌水。3.大黄牡丹汤对IBD小鼠的治疗作用每天记录小鼠的体重、粪便性状、便血等情况,并评分,计算疾病活动指数。同时通过结肠长度、脾脏指数、结肠病理组织学HE染色、结肠病理学评分、外周血粒细胞数量及比例、结肠髓过氧化物酶(MPO)活性、结肠IL-1β含量,探究大黄牡丹汤对IBD小鼠的治疗作用。4.大黄牡丹汤对IBD小鼠肠道菌群及SCFAs的调节作用通过传统的平板计数法和16SrDNA测序法检测小鼠肠道菌群数量及丰度;气相色谱与质谱联用法检测小鼠盲肠内容物中的SCFAs,研究大黄牡丹汤对IBD小鼠肠道菌群的影响。5.大黄牡丹汤对IIBD小鼠Th17/Treg细胞及其细胞因子的影响流式细胞术检测小鼠脾脏、肠系膜淋巴结中Th17和Treg细胞数量及其占CD4+T细胞比例;WB法和免疫组化法检测IL-17A和Foxp3在小鼠结肠中的表达及分布情况;流式细胞术及酶联免疫吸附技术检测小鼠结肠中Th17/Treg细胞相关细胞因子IL-6、IL-17A、IL-21、IL-22、TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-β 含量。结果1.大黄牡丹汤质量控制运用高效液相色谱法检测大黄牡丹汤指纹图谱并与特征性标准化合物进行比对,发现大黄牡丹汤中含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和葫芦巴碱等活性物质,并对大黄牡丹汤的指纹图谱进行了初步确定。2.大黄牡丹汤对IBD小鼠的治疗作用IBD动物模型的诱导方法有多种,其中小鼠自由饮用DSS诱导的IBD模型,操作简单,成功率高,重复性好,可根据动物品种、性别选择合适的药物浓度和造模时间。本课题采用C57BL/6小鼠自由饮用2.5%DSS 5天即可成功诱导形成IBD模型。与正常组小鼠比较,DSS诱导的IBD小鼠出现体重显著下降,稀便、血便明显等IBD症状,DAI评分显著升高,结肠明显缩短,并伴有水肿、溃疡等病变,脾脏指数显著升高;结肠病理切片HE染色显示结肠组织结构不完整,粘膜受损,糜烂,肠腺减少,杯状细胞减少,大量炎症细胞浸润至粘膜下层,溃疡面明显,组织病理学评分显著升高,结肠MPO活性升高,IL-1β含量增多,差异显著(P<0.01,P<0.001)。美沙拉嗪可在一定程度上降低小鼠体重下降幅度,在第9天和第11天与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);DAI评分在第8和第10天也明显低于模型组(P<0.05,P<0.001);结肠病理组织学评分、脾脏指数、结肠MPO活性、结肠IL-1β含量和外周血粒细胞比例明显低于模型组(P<0.05,P<0.01);但是对小鼠结肠缩短及其结构完整性没有较好的保护作用。大黄牡丹汤各剂量(含生药量分别为0.25g/mL、0.50g/mL、1.00g/mL)均能显著减少IBD小鼠体重的下降,降低小鼠DAI评分,明显抑制小鼠结肠缩短,维持结肠结构完整性,减少溃疡的产生,改善小鼠结肠炎症状态,显著降低脾脏指数、结肠MPO活性、血清和结肠IL-1β含量,减少外周血粒细胞数量及比例,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。3.大黄牡丹汤对IBD小鼠肠道菌群的调节作用3.1肠道菌群体外平板计数法检测结果传统平板培养法培养的小鼠肠道细菌显示DSS诱导的IBD小鼠肠道菌群中放线菌门(Actinobacteria)代表菌双歧杆菌(Bifidobacterium)显著减少(P<0.001),厚壁菌门(Firmicutes)中的代表菌乳酸杆菌和拟杆菌门(Bacteroidetes)代表菌脆弱拟杆菌增多,但是差异不明显;变形菌门(Proteobacteria)代表菌大肠杆菌明显增多(P<0.05)。经大黄牡丹汤灌胃干预后,与模型组比较,大黄牡丹汤各剂量组,尤其是中剂量组和高剂量组,小鼠肠道的双歧杆菌明显增多(P<0.05,P<0.01);乳酸杆菌和脆弱拟杆菌有所减少,但差异不明显。大肠杆菌有所减少,大黄牡丹汤高剂量效果较明显(P<0.05)。3.2肠道菌群16S rDNA测序结果16SrDNA测序法检测小鼠肠道菌群的结果显示,模型组物种丰度下降,多样性减少;在门水平,Actinobacteria和Firmicutes相对丰度显著减少,Bacteroidetes、Proteobacteria 和 Verrucomicrobia 相对丰度明显增多;在属水平,Bifidobacteerium、Butyricicoccus、Desulfovibrio显著减少,Bacteroides、Butyricimonas、Escherichia和Akkermansia明显增多。美沙拉嗪对肠道菌群物种丰度及多样性的影响不明显。大黄牡丹汤可显著提高放线菌门细菌(双歧杆菌等)和厚壁菌门细菌(乳酸杆菌、丁酸产生菌等)相对丰度,降低变形菌门细菌(γ变形菌中大肠杆菌等)和拟杆菌门细菌(拟杆菌等)的丰度,尤其是显著提高Butyricicoccus、Desulfovibrio相对丰度和降低Bacteroides、Butyricimonas的相对丰度。另一方面,大黄牡丹汤也提高了肠道菌群的多样性,对改善并稳定肠道稳态有积极作用。3.3肠道菌群主要代谢产物SCFAs的检测结果DSS诱导的IBD小鼠乙酸、丙酸和丁酸下降明显,与正常组比较,差异显著(P<0.01,P<0.05和P<0.01);美沙拉嗪组小鼠乙酸、丙酸和丁酸含量有升高的趋势,但与DSS组比较差异不明显;大黄牡丹汤各剂量组乙酸、丙酸的含量均明显高于模型组(P<0.05,P<0.001或P<0.01)。大黄牡丹汤低剂量组丁酸含量稍微比模型组高,但差异不明显;大黄牡丹汤中、高组丁酸的含量也明显高于模型组(P<0.01,P<0.05)。4.大黄牡丹汤对IBD小鼠Th17/Treg细胞及其细胞因子的调节作用4.1大黄牡丹汤对IBD小鼠Th17/Treg细胞调节作用DSS诱导的IBD小鼠肠系膜淋巴结中Th17细胞比例明显高于正常组,Treg细胞比例显著减少(P<0.001);美沙拉嗪组Th17细胞比例下降明显,Treg细胞比例显著上升,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。大黄牡丹汤治疗后,各剂量均能逆转模型组Th17和Treg细胞比例,中剂量和高剂量效果显著(P<0.01,P<0.001)。DSS诱导的IBD模型组小鼠脾脏中Th17和Treg细胞比例均显著升高,与正常组比较,有显著性差异(P<0.01,P<0.001)。美沙拉嗪组小鼠Th17细胞比例增加,Treg细胞比例显著减少,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。大黄牡丹汤治疗后,各组小鼠均能恢复Th17和Treg细胞比例,中剂量和高剂量效果显著(P<0.05,P<0.001)。DSS诱导的IBD小鼠结肠固有层中IL-17A和Foxp3的表达明显增多,美沙拉嗪和大黄牡丹汤中、高剂量组小鼠结肠固有层中IL-17A和Foxp3明显减少。4.2大黄牡丹汤对IBD小鼠Th17/Treg细胞相关细胞因子的调节作用细胞因子检测结果显示,DSS诱导的IBD小鼠结肠匀浆中IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-22、IL-10等的细胞因子含量显著高于正常组(P<0.001或P<0.05);IL-21的含量也高于正常组,但是个体差异较大,结果无统计学差异;TGF-β的含量显著低于正常组(P<0.001)。美沙拉嗪治疗后,小鼠结肠中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-10的含量显著低于模型组(P<0.001或P<0.01);IL-21和IL-22的含量低于模型组,但差异无统计学意义;TGF-β的含量高于模型组,但差异无统计学意义。大黄牡丹汤治疗后,对炎症细胞因子的调节作用比较显著。大黄牡丹汤各剂量组组小鼠IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-10等的细胞因子含量显著低于模型组(P<0.001或P<0.01)。同时,大黄牡丹汤对TNF-α的抑制有剂量依赖性(P<0.001或P<0.01)。大黄牡丹汤各剂量均能减少IL-21的分泌,但与模型组比较无显著性差异。另外,大黄牡丹汤还能剂量依赖性地促进TGF-β的分泌,其中高剂量组与模型组组相较,差异显著(P<0.01)。结论1.DSS诱导IBD小鼠模型肠道炎症及溃疡明显,肠道菌群紊乱;肠道菌群主要代谢产物SCFAs减少;整体和局部Th17/Treg细胞比例失衡;相关炎症细胞因子分泌水平异常。2.大黄牡丹汤能改善DSS诱导的IBD小鼠的炎症状态,调节并在一定程度上恢复肠道菌群数量及其多样性;调节并恢复Th17/Treg细胞比例及其分泌的细胞因子水平。大黄牡丹汤对IBD的治疗作用机制可能与调节肠道菌群、SCFAs进而恢复Th17/Treg细胞比例及相关细胞因子水平有关。