论文部分内容阅读
相对于病毒载体来说，非病毒载体安全性更高，但转染率低。其转染率低的原因是非病毒载体在传递DNA过程中存在更多机体生理上的屏障，其中从溶酶体释放的过程和传递入核的过程是影响DNA最终能否表达的关键步骤。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是一种阳离子聚合物，也是目前常用的非病毒载体。高分子量的PEI转染率高但毒性较大，不适合于体内应用；而分子量低于2000的小分子PEI不显细胞毒性，却不能很好的压缩DNA，转染效率低。为结合高分子量PEI转染效率高和低分子量PEI毒性低的优点，本研究设计将低分子量PEI(800Da和189Da)接枝于聚谷氨酸的主链上，制备可降解的PLG-g-PEIs(PLGE)，以期得到毒性低、可降解且转染率高的聚合物基因传递载体。
组蛋白(Histone)是真核生物细胞核中染色质的主要蛋白组分，富含赖氨酸和精氨酸，所带的正电荷能与DNA结合成DNA-组蛋白复合物。在组蛋白的氨基末端还含有核定位信号(nuclear location signal,NLS)功能片段，在突破核膜屏障的过程中起着重要的作用。
氯喹是一种亲溶酶体剂，可以通过提高内涵体的pH值，诱导内涵体发生膨胀而使得膜不稳定，有助于DNA复合物从内涵体脱离出来，避免溶酶体对DNA复合物的降解，从而提高转染效率。
本文制备聚谷氨酸-聚乙烯亚胺/组蛋白/氯喹多元组合作为基因传递系统，以期通过系统的优化，使该传递系统能突破细胞转运的三道主要屏障：聚谷氨酸-聚乙烯亚胺/组蛋白正电荷的作用于细胞膜，以内吞形式进入细胞，突破细胞膜屏障；PEI的质子海绵效应和氯喹对溶酶体的作用，突破溶酶体屏障；组蛋白的核靶向作用突破核膜屏障。通过这三道屏障，最终达到低毒高效的效果。
本文主要讨论以下几个方面的内容：
(1)共聚物PLGE的合成和表征。
以PEI(189Da)引发聚谷氨酸苄酯羧酸酐(BLG-NCA)制得聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(PEI-b-PBLG)，分别以小分子PEI(800Da)和PEI(189Da)对PEI-b-PBLG中PBLG嵌段进行氨解，PEI作为侧链接枝于聚谷氨酸主链上，制成聚合物PLGE，通过1HNMR和GPC对共聚物进行结构表征。
(2)组蛋白、聚合物PLGE和氯喹的细胞毒性研究。
以MTT法考察组蛋白、PLGE和氯喹的细胞毒性。结果显示，组蛋白在有血清存在的情况下，对Hela细胞与HUVEc细胞不显示细胞毒性；在无血清的情况下，100μg/mL的组蛋白仍显示较小的毒性，Hela细胞和HUVEc细胞存活率均在80％以上。氯喹在浓度低于200μmol/L时对细胞毒性较低。聚合物PLGE的细胞毒性与PEI25k相比有显著降低。
(3)pDNA/histone/PLGE三元复合物形成的研究。
利用圆二色光谱(CD)证明pDNA与histone、pDNA与histone/PLGE之间的相互作用。利用原子力显微镜(AFM)观察pDNA和pDNA/histone二元复合物以及pDNA/histone/PLGE三元复合物的表面形貌，结果显示histone可以和DNA形成50nm左右的球形粒子，而PLGE能将pDNA/histone粒子进一步压缩至20nm左右。
(4)pDNA/histone/PLGE复合物的性能研究。
以琼脂糖凝胶电泳实验考察histone和PLGE以及复合PLGE与histone对DNA的压缩能力。结果表明，histone在与DNA的重量比达到1∶1的时候即可与DNA紧密结合，不会有DNA条带跑出；PLGE 800在N/P=1的时候已可完全压缩DNA；histone与PLGE协同作用的时候，PLGE在N/P=0.8时即可完全压缩DNA。以动态光散射法(DLS)测定pDNA/histone和pDNA/histone/PLGE在5％葡萄糖注射液中的粒径，结果显示pDNA/histone粒径范围在200nm左右，复合PLGE后粒径有所减小，均在200m以下。以不同量histone复合DNA后测定电位值均低于-25mV,pDNA/histone/PLGE三元复合物的电位则在15-18mV之间，复合物具有良好的稳定性。
(5)pDNA/histone/PLGE复合物及组合氯喹后的体外转染研究。
以流式细胞仪和荧光显微图片考察pDNA/Histone/PLGE复合物及组合氯喹后的复合物的转染效率。结果显示，在histone与DNA的质量比为0.8∶1，PLGE与pDNA的N/P=15时，转染率达到最大值62.4％；histone/PLGE/氯喹多元组合基因传递系统的转染率相比未加氯喹的转染率有所下降，细胞形态也有所变化，可能是由于氯喹对组蛋白和DNA之间的相互作用产生影响，从而削弱了组蛋白的核靶向作用，或者是复合材料增加了细胞毒性的原因。激光共聚焦图片说明pDNA/histone/PLGE复合物突破核膜屏障的能力比Lipofectamine 2000和PEI 25k更强。
(6)pDNA/histone/PLGE复合物在果蝇体内的转染研究。
将体外细胞试验筛选出的最佳转染复合物pDNA/histone/PLGE 800进一步进行体内试验，以果蝇作为试验对象，转染后用imageJ图像分析软件获得荧光图片的相对荧光强度，结果显示转染复合物pDNA/histone/PLGE800的体内转染效果优于市售转染试剂Lipofectamine 2000和阳离子聚合物PEI 25k。
综上所述，本文构建聚谷氨酸-聚乙烯亚胺/组蛋白/氯喹多元组合基因传递系统，筛选出最优转染复合物pDNA/histone/PLGE 800，在组蛋白与pDNA重量比为0.8∶1，N/P=15时转染达到最大值，与Lipofectamine 2000和阳离子聚合物PEI 25k相比，该基因传递系统具有低毒高效的特点。