【摘 要】
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目的:1) 以RT-PCR方法构建AFP基因真核表达载体pEGFP-AFP并进行鉴定;2) 以RT-PCR方法克隆含真核表达元件Kozak序列、启始密码子但不含终止密码子的AFP基因cDNA,连接AFPcDNA与
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目的:1) 以RT-PCR方法构建AFP基因真核表达载体pEGFP-AFP并进行鉴定;2) 以RT-PCR方法克隆含真核表达元件Kozak序列、启始密码子但不含终止密码子的AFP基因cDNA,连接AFPcDNA与mtP53基因构建融合基因真核表达载体pEGFP-AFP-mtP53并进行鉴定;3) 采集肝癌患者外周血CD34~+细胞,体外诱导培养DC并进行鉴定;4) 将AFP-mtP53融合基因转染DC,诱导DC产生针对AFP和mtP53抗原的特异性CTL反应,并与AFP和mtP53单基因转染诱导的特异性CTL反应比较,观察其对不同肝癌细胞株的杀伤抑制效果,评价以AFP和mtP53双抗原致敏DC诱导的针对AFP和mtP53双靶点的特异性抗肝癌CTL活性。 方法:1) 体外培养人肝癌细胞HepG2,Trizol裂解细胞,提取总RNA。设计含有特定酶切位点Bgl Ⅱ、真核启动元件Kozak序列和起始密码子ATG的PCR正向引物;含有特定酶切位点Sal Ⅰ和终止密码子TAA的PCR反向引物。采用RT-PCR法克隆AFP全长cDNA,使用BglⅡ+Sal Ⅰ双酶切载体pEGFP-mtP53和AFP cDNA,将AFP cDNA连接载体pEGFP,构建新的真核表达载体,命名为pEGFP-AFP。并对真核表达载体pEGFP-AFP进行测序,保存测序正确克隆。采用脂质体转染技术将真核表达载体pEGFP-AFP转染
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