第一章Profilin-1在AGEs诱导的内皮损伤中的作用研究背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)发病率逐年上升,糖尿病血管病变引发的并发症是糖尿病致残、致死的主要原因之一。而糖尿病患者若长期处于高血糖状态后,即使日后长期严格控制血糖,糖尿病相关的慢性并发症仍继续存在甚至发展,这种现象称为“代谢记忆(metabolic memory)"或“高血糖记忆(hyperglycemic memory)"。大量研究显示,若糖尿病患者血糖长期得不到很好的控制,其体内的糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)经过一系列的非酶糖化、脂质氧化而产生,导致晚期糖基化终产物(晚期糖化终产物,AGEs)的生成会增加,这些因素可能是生成的“代谢记忆”的主要原因。AGEs介导的“代谢记忆”致血管病变的机制尚未完全阐明。Profilin-1是一种小分子量的肌动蛋白结合蛋白,广泛存在于除骨骼肌之外的机体组织,可调节肌动蛋白聚合及解聚过程；参与调节细胞的增殖、分化和运动过程以及信号转导。体外研究显示：AGEs可引起内皮细胞骨架肌动蛋白的重组和再分布,导致内皮细胞通透性增加,提示profilin-1可能是AGEs诱导的内皮细胞损伤的靶分子。本章主要体外培育人脐静脉内皮细胞,通过外源性的AGEs刺激内皮细胞,观察AGEs对于内皮细胞的损伤作用,同时观察profilin-1在AGEs刺激内皮细胞中的表达。方法培养人脐静脉血管内皮细胞株,分别用不同浓度(100mg/l,200mg/l,400mg/l) AGEs处理24小时；继而选用使用AGEs(200mg/l)处理内皮细胞不同时间(6h,12h,24h,48h);使用AGEs (200mg/l,24小时)处理人脐静脉内皮细胞后,分别检测细胞上清液NO、ADMA> ICAM-1因子水平,免疫荧光染色检测F-actin的分布和Profilin-1的表达,Western blot检测profilin-1蛋白表达,共聚焦扫描显微镜直接观察活性氧的改变。结果1、不同浓度的AGEs (100mg/L、200mg/L、400mg/L)孵育内皮细胞24h均可使Profilin-1蛋白表达上调,但以200mg/L明显。2、200mg/L的AGEs呈时间依赖性的上调内皮细胞Profilin-1的蛋白表达,后续实验均选用200mg/L作用内皮细胞24小时。3、AGEs诱导的profilin-1对内皮细胞结构的改变。4、AGEs (200mg/L)处理内皮细胞24h可显著升高细胞培养上清液中ADMA、ICAM-1水平,降低NO水平。5、AGEs (200mg/L)处理内皮细胞24h后,细胞形态变得很不规则,绿色荧光明显增加,提示AGEs明显增加细胞内活性氧水平。结论Profilin-1在AGEs介导的血管内皮损伤过程中起到关键的作用。第二章Profilin-1基因沉默后AGEs诱导的内皮细胞的表达研究背景糖尿病血管病变的发病机制复杂,迄今仍未阐明。目前普遍的观点认为：长期的高血糖使线粒体功能下降,产生过量的超氧化物,细胞蛋白、核酸被糖化导致大量的AGEs生成,AGEs本身可直接修饰线粒体蛋白,抑制其修复,生成更多的超氧离子。这种损害随着高血糖时间延长而积累,此时即使纠正高血糖,AGEs的损害仍持续存在,其导致的血管损伤仍会继续加速血管病变的进展。近年来有学者提出线粒体AGEs形成是不可逆的现象,可以解释长期“代谢记忆”的本质的观点。AGEs的间接作用主要是由其受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)介导,AGEs与RAGE结合后,诱导细胞内氧自由基大量产生,后者作为信号分子通过细胞内信号级联反应,激活蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)和核因子-B(nuclear factor kappa B,NF-B),最终活化糖尿病相关并发症发生的通路。基于此,我们进行了关键的预实验,结果发现：STZ糖尿病大鼠主动脉profilin-1表达增加；在培养的内皮细胞,高糖(30mM,24h)刺激对profilin-1的表达没有影响,而给予AGEs (50g/ml,24h)处理后可显著上调profilin-1的表达,这一现象与长时间高糖刺激AGEs形成后介导的“代谢记忆”相吻合。因此,我们推测profilin-1很可能与AGEs介导的“代谢记忆”相关,以profilin-1为靶点展开研究有望更清晰的阐释“代谢记忆”的发生机制,并从细胞内途径阻断AGEs诱导的血管损伤。在先前的实验已经证实了profilin-1介导的AGEs在内皮细胞损伤中的作用。而本章课题设计AGEs依赖的profilin-1表达上调机制及信号转导通路；并应用基因沉默技术,直接论证profilin-1在AGEs诱导的血管内皮损伤和血管病变中的关键作用,试图寻找新的抗血管病变发生的作用靶点,为开发和研制新药提供理论依据。方法培养人脐静脉血管内皮细胞株,并由上海吉凯基因化学技术有限公司合成profilin-1siRNA质粒,将profilin-1siRNA质粒成功转染人脐静脉血管内皮细胞株,采用Real-Time PCR及Werstern-Blot法检测profilin-1基因沉默效果；采用AGEs+Profilin-1干扰组、AGEs+DPI(10umol/1)组、AGEs+BAY-117802(5umol/l)组、AGEs+GF109203X (10umol/l)组分组,分别检测其profilin-1的表达,以及细胞上清液中ADMA、ICAM-1、NO水平。PKC与NF-KB信号转导途径抑制剂预处理正常人脐静脉血管细胞株,以此来证明AGEs诱导的内皮细胞损伤的信号通路的可能机制。结果1、AGEs组诱导的Profilin-1表达明显高于对照组(P<0.05)以及AGEs+Profilin-1干扰组(P<0.01)(图2-1)。2、经pLNCX2-Profilin-1干扰质粒以及给予各种抑制剂孵育内皮细胞可明显减少AGEs所致的ADMA、ICAM-1水平的升高,且增加NO的生成。3、AGEs组诱导的Profilin-1表达较各个抑制剂组以及AGEs+Profilin-1干扰组明显升高；各个抑制组与AGEs+Profilin-1干扰组的细胞profilin-1mRNA表达与AGEs组相比明显降低。4、AGEs组较其他组相比较,内皮细胞24h后细胞形态变得很不规则,绿色荧光明显增加,提示AGEs明显增加细胞内活性氧水平。5、免疫荧光染色显示使用AGEs组其绿色荧光水平明显高于对照组,其进一步表明,在使用AGEs (200g/ml)孵化24h后其profilin-1的表达水平明显上调。使用DPI, GF109203x和BAY-117082等抑制剂处理后,其表达profilin-1的绿色荧光显著降低,表明其profilin-1的生成由于使用DPI, GF109203x和BAY-117082等抑制剂后而减少。6、免疫荧光染色显示,沉默profilin-1基因表达显著减少细胞质中profilin-1的表达,并且改善了由于AGEs诱导的F-肌动蛋白重组及分布。总的来说,这些结果证实AGEs通过增加profilin-1在细胞质中的水平,从而诱导内皮细胞肌动蛋白细胞骨架重组以及再分配。并通过PKC和NF-κB通路作为AGEs介导的profilin-1的激活。结论沉默profilin-1基因可以使AGEs诱导的内皮细胞损伤显著改善,且profilin-1可能是内皮损伤最终的和共同的下游效应。第三章AGEs介导的大鼠中profilin-1的表达研究背景2010年,根据ADA(美国糖尿病协会)的统计数据,我们可以发现长期(3年以上)糖尿病患者,其出现并发症的几率将近5成,而更长期(5年以上)的糖尿病患者,出现并发症的几率甚至达到了6成以上,而超长期(10年以上)的糖尿病患者,出现并发症的几率机会是100%。随着对于糖尿病的认识的深入,越来越多的糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者被发现,而大部分糖尿病患者发现有糖尿病的时候,其导致的血管病变所引发的并发症是糖尿病致残、致死的主要原因之一。对于那些长期高血糖的患者,包括严格控制血糖及强效降脂等在内的综合治疗手段并不能有效防止糖尿病血管并发症的发生发展。因此,深入探讨糖尿病血管病变的发生机制,而糖尿病血管病变包括许多的方面。我们先前的体外实验已经证实了AGEs诱导的profilin-1表达的增加,从而导致了内皮细胞的损伤,并且证实了通过PKC和NF-κB通路作为细胞信号通道。本课题拟在AGEs诱导的血管病变大鼠模型,试图证明在动物体内其AGEs仍然通过profilin-1的表达,从而导致血管的受损,进而导致糖尿病并发症的发生。为寻找新的抗血管病变发生的作用靶点,为开发和研制新药提供理论依据。方法采用SD大鼠尾静脉注射AGEs-BSA(25mg/kg, iM qd,连续2月)诱导血管损伤模型,采用HE染色、免疫组化(Immunohisto-chemistry, IHC)检测组织形态学变化及相关指标的改变,采用Western blot及real-time PCR检测主动脉profilin-1的表达。结果1、各组大鼠实验前体重情况比较无明显差异。2、HE染色可见AGEs组与对照组大鼠相比,随着使用AGEs培育时间的延长,其内皮细胞以及血管形态均发生改变。肾脏组织的免疫组化示：AGEs组大鼠随着使用AGEs培育时间的延长,肾小球受损伤,以及可见炎症分布和淋巴细胞浸润。3、与正常对照组相比,随尾静脉给药时间的增加profilin-1蛋白表达量明显增加；且profilin-1mRNA表达量明显增加。4、随着使用尾静脉注射AGEs时间的延长,大鼠的ICAM-1以及ADMA的水平与对照组相比增加,而NO的水平与对照组相比减少。结论AGEs诱导的profilin-1对于大鼠内皮细胞以及重要脏器均有损伤作用。