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研究背景分拣微管连接蛋白17(Sorting nexin 17,SNX17)是分拣微管连接蛋白家族的成员,其特征是有一个phox-homology(PX)结构域,通过与特定磷脂酰肌醇相互作用将SNXs定位于细胞内囊泡;此外还有一个FERM结构域,通过识别低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor,LDLR)家族成员胞质结构域中的NPxY基序,避免LDLR在溶酶体降解,使其重新回到细胞膜发挥受体功能,促进相关受体蛋白的高效重复利用。低密度脂蛋白受体相关蛋白 4(Low-density lipoprotein receptor related protein 4,LRP4)是LDLR家族的Ⅰ型单跨膜蛋白,其C末端存在含有NPxY基序,LRP4作为受体蛋白与突触前膜运动神经元分泌的Agrin结合,促使MuSK发生酪氨酸磷酸化,诱导乙酰胆碱受体聚集于终板膜。最新研究表明LRP4是重症肌无力的一种新型靶抗原。C2C12细胞可被诱导分化融合形成多核的具有收缩性的肌管细胞,用于重症肌无力研究的细胞模型,对C2C12细胞分化以及相关受体的表达研究对研究神经肌肉接头功能和修复是非常重要的。早期免疫共沉淀实验证实SNX17与LRP4胞内区可直接结合,推测:当LRP4发生内陷时,其胞质尾区的NPxY基序与SNX17的FERM区绑定,随后SNX17的PX结构域与早期内体膜上的磷脂酰肌醇相结合,即SXN17可以介导LRP4进入早期内体,逃避溶酶体降解途径,重新回到细胞膜再循环利用,可以提高乙酰胆碱受体聚集相关蛋白的高效重复利用。目的为验证研究假说,本课题以C2C12细胞为研究对象,利用慢病毒转染技术,探讨慢病毒介导的SNX17沉默及过表达对C2C12肌管细胞乙酰胆碱受体聚集相关蛋白表达的影响。方法1.C2C12细胞培养与鉴定:C2C12细胞在完全培养基进行培养、使用2%的马血清诱导分化,使用10ng/mL的Agrin进行孵育16h后,进行荧光标记的α-BTX染色。2.沉默C2C12细胞SNX17:设计和筛选SNX17 shRNA,构建SNX17慢病毒干扰质粒,转染293T细胞,western blot检测SNX17表达水平;慢病毒shRNA的慢病毒干扰质粒、两个辅助慢病毒包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装,荧光计数法进行慢病毒颗粒滴度检测;感染C2C12细胞;qPCR及western blot验证SNX17的shRNA靶序列。3.过表达C2C12细胞SNX17:构建SNX17慢病毒过表达质粒,进行慢病毒包装和滴度检测,感染C2C12细胞,western blot验证SNX17过表达。4.Western blot检测干扰及过表达C2C12细胞SNX17后乙酰胆碱聚集相关蛋白LRP4及MuSK的表达。结果1.C2C12成肌细胞可被2%马血清的DMEM培养基诱导分化为肌管细胞,在Agrin刺激肌管细胞16h后,可见肌管细胞表面的红色荧光聚集,红色荧光聚集簇的数量和长度明显高于未使用Agrin刺激组,且差异有统计学意义(P<0.05)。2.四个SNX17 shRNA以及shRNA-NC质粒构建成功,测序符合预期,质粒转染293T细胞效率高于70%,其中SNX17 shRNA-2组对SNX17蛋白水平的沉默效率达到30%左右;SNX17 shRNA以及shRNA-NC慢病毒颗粒感染肌管细胞效率高于60%;SNX17 shRNA-2组在基因和蛋白水平对SNX17的沉默效率最高,分别为46%左右和50%左右,具有统计学意义(P<0.05)。3.SNX17 OE以及SNX17 OE-con质粒构建成功,测序结果符合预期,SNX17 OE以及SNX17 OE-con组慢病毒颗粒感染肌管细胞效率高于60%,SNX17蛋白过表达水平高于对照组1倍以上,有统计学意义(P<0.05)。4.SNX17干扰组LRP4表达水平相比于shRNA-NC组差异无统计学意义(P>0.05),MuSK表达水平相比于shRNA-NC组显著降低,具有统计学意义(P<0.05)。5.SNX17过表达组LRP4表达水平相比于SNX17 OE-con组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);MuSK表达水平相比于SNX17 OE-con组显著增高,具有统计学意义(P<0.05)。结论1.C2C12细胞可被2%马血清诱导为C2C12肌管细胞,肌管细胞能够在Agrin的刺激下出现nAChR聚集。2.干扰C2C12肌管细胞SNX17,LRP4蛋白表达下降,MuSK蛋白表达水平显著降低;C2C12肌管细胞SNX17过表达,LRP4蛋白和MuSK蛋白表达水平显著增高。说明,SXN17存在使LRP4重新回到细胞膜再循环利用的可能。