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酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是指由于长期过量饮酒所诱发的肝脏系统疾病。酒精摄入对机体的影响取决于多方面的因素,包括摄入方式(过量与否、急性或慢性),机体外环境(饮食习惯)以及个体本身因素(性别、基因多态性)等。过量的酒精摄入曾经成为西方国家肝病相关死亡病例的主要诱因之一,但近年来随着亚洲地区的经济发展,人均收入的提升,居民酒精摄入增加,ALD在亚洲地区发病率迅速上升。世界卫生组织国际癌症研究机构于2017年将含酒精饮料中的乙醇归为一类致癌物。因此ALD如今已成为一个全球性的健康问题。但ALD并不是某一种单一性的疾病,它是一个复杂的病理过程,囊括多种肝脏损伤,例如:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化以及酒精性肝硬化。组织学上,ALD表现为肝细胞脂肪变性、膨胀和凋亡,肝叶炎症浸润,细胞外基质沉积增多,形成再生性结节等。目前普遍认为,酒精导致的肝脏脂肪变性是晚期肝脏系统疾病(肝硬化、肝癌)的诱因之一,在所有肝硬化的病例中,酒精性肝硬化约占据50%的比例。而一旦肝硬化发生,疾病的恶化便很难再逆转。因此将ALD阻断在脂肪变性阶段,并且促使其逆转具有重要的研究意义。酒精性脂肪肝是一个以肝细胞损伤,细胞内脂肪滴沉积,炎症细胞浸润肝组织为典型症状的系统性疾病。酒精在机体内代谢产物乙醛直接对肝细胞产生毒性作用,导致细胞间隙变大,空泡增加,累积后导致肝索紊乱,肝脏正常结构遭到破坏。同时酒精刺激一方面可上调固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c),促进脂质合成。另一方面下调氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activating receptorα,PPAR-α),减少脂肪酸氧化。双管齐下,导致肝细胞内脂滴过度沉积,肝脏脂肪变性。本研究便尝试寻找在酒精性脂肪肝中具有异常改变,并参与调控疾病进程的研究目标,试图为ALD防治提供新的思路。近年来研究发现,参与机体固有免疫的NOD样受体家族成员在众多非免疫应答反应中具有重要作用。其中最大的家族成员NLRC5被证实可通过多个信号通路促进肝细胞癌以及肝纤维化疾病的发生发展。课题组建立了Binge小鼠酒精性脂肪肝模型,并构建了NLRC5基因敲除小鼠,以此深入探讨NLRC5在早期的酒精性脂肪肝中可能存在的异常改变、生物学功能和分子作用机制。实验首先检测Binge模型中酒精喂养组小鼠肝脏中NLRC5表达情况。免疫组化及Western Blot实验均证实NLRC5基因在脂肪变性的小鼠肝脏中存在高表达现象。进一步,分别对野生型小鼠和NLRC5基因敲除小鼠进行Binge模型建立。造模期结束后,取小鼠血清进行生化指标检测,收集肝组织进行病理学和相关基因免疫组化检测。采用原位灌流技术分离肝脏中肝细胞及枯否细胞进行相关基因Realtime-q PCR以及Western Blot检测。实验结果发现,相比较于野生型小鼠,NLRC5基因敲除小鼠血清中甘油三脂(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)以及天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)浓度均降低。HE以及油红O染色显示酒精喂养的野生型小鼠肝脏正常结构遭到破坏,空泡较多,脂滴沉积明显。而与野生型小鼠相比,NLRC5基因敲除小鼠经历酒精饲料喂养后,肝脏损伤和脂肪变性程度较轻。并且Realtime-q PCR以及Western Blot检测后发现NLRC5基因的敲除缓解了酒精诱导的SREBP-1c和PPAR-α的异常表达。这提示NLRC5基因敲除后,小鼠肝脏对酒精产生一定耐受,不易于发生酒精诱导的肝损伤和脂肪变性。灌流分离小鼠肝细胞及枯否细胞进行检测后发现NLRC5基因的异常改变主要发生于肝细胞中,因此体外采用永生化的小鼠AML-12肝细胞株进行NLRC5基因的沉默以及过表达实验。与体内实验结果一致,NLRC5沉默对肝脏具有保护性作用,而NLRC5基因过表达加重了酒精的毒性作用。进一步研究发现,同样酒精饲料喂养条件下,NLRC5基因敲除小鼠肝脏中自噬小体多于野生型小鼠。通常情况下,微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)的表达上升以及多功能蛋白sequestome 1(p62/SQSTM1,p62)表达降低被认为是自噬现象发生的标志。Western Blot实验结果也证实NLRC5基因敲除小鼠肝脏中LC3-Ⅱ与p62蛋白表达水平的改变。有趣的是,自噬作为一种高度保守的细胞内分解代谢过程,被认为可能在酒精性脂肪肝的发展中发挥保护性作用。本实验中,在进行小鼠酒精性脂肪肝模型建立的同时合并给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin),发现3-MA抑制小鼠体内自噬现象后,小鼠肝脏中酒精导致的肝损伤和脂肪变性加剧,而雷帕霉素诱导自噬发生后,酒精的肝脏毒性作用被减弱。这一结果证实了自噬缓解酒精对肝脏的损伤作用。前期结果证实敲除NLRC5可诱导自噬发生,因此本实验中给予NLRC5基因敲除小鼠腹腔注射3-MA,观察自噬被抑制后是否影响敲除NLRC5的生物学功能。与实验设想一致,与注射对照溶剂的NLRC5基因敲除小鼠相比,合并给予3-MA后喂养酒精饲料可引起小鼠血清中TG和T-CHO水平升高,肝脏中空泡和脂滴沉积增多,相应的调控脂肪生物合成与代谢的基因表达水平也发生了改变。实验结果提示3-MA抑制自噬后,可能部分阻断了敲除NLRC5基因所带来的肝脏保护性作用。以上研究表明,NLRC5在机体酒精摄入后表达水平异常增加,可能参与到酒精性脂肪肝的发病过程。然而敲除NLRC5后酒精诱导的肝脏损伤和脂肪变性现象得到缓解,并且这一生物学功能可能与自噬现象相关。