本课题以普朗尼克(Pluronic)为高分子材料,制备一种在体内循环系统中稳定的、耐稀释的、并且能主动靶向细胞内的纳米给药系统。以普朗尼克F127(PluronicF127)为基础材料在水溶液中形成胶束,为克服胶束进入体内循环系统被稀释后易于分解现象,以聚乙烯亚胺为交联剂,采用外壳交联的方法将普朗尼克F127外壳交联,形成稳定的纳米粒；用叶酸对纳米粒表面进行修饰,制备能够携带药物主动靶向癌细胞内的纳米给药系统；通过细胞实验和动物实验验证所制备的纳米靶向给药系统靶向细胞内的能力以及体内分布靶向性。探索抗肿瘤药物靶向给药治疗的新方法、新思路、新技术,为临床治疗提供有效方法。　　 普朗尼克是聚氧乙烯和聚氧丙烯醚嵌段共聚物,能在水溶液中自组装成胶束载体系统,近十年来受到药学专家及学者的广泛关注。由于普朗尼克分子两端含有羟基,可以作为活性基团,用交联剂进行交联,防止其稀释分解,从而制备外壳交联的稳定化胶束。研究表明,外壳交联能够极大提高胶束稀释后的稳定性,提高胶束抵抗体液冲稀的能力。同时交联后形成网状结构,吸水后体积膨胀,具有微凝胶的特性,提高载药能力。　　 聚乙烯亚胺(PEI)是一种富含大量氨基的阳离子聚合物,在基因转染方面具有重要作用。研究表明基于聚乙烯亚胺的药物载体能够响应内涵体和溶酶体内较低的酸性环境,能破坏溶酶体,将药物释放到细胞内乃至各种细胞器内发挥疗效。在本课题中,将其作为交联剂与普朗尼克分子两端羟基反应,制备在水溶液中稳定存在的纳米粒。　　 叶酸(Folate,Fa)是一种人体必需的维生素,用于维持体内细胞的生长发育,在肿瘤治疗领域广泛应用。叶酸受体在卵巢癌、乳腺癌、脑癌、肺癌等一些肿瘤细胞中高度表达。叶酸作为一种肿瘤组织靶向因子能够避开正常组织细胞,可提高肿瘤组织的蓄积能力。　　 本课题主要研究了叶酸介导的普朗尼克F127/聚乙烯亚胺纳米粒的制备,研制了以紫杉醇(Paclitaxel,PTX)为模型药物的纳米给药系统。在聚乙烯亚胺对普朗尼克F127的修饰中,以CMC值为优化指标,通过均匀设计对共聚物的工艺条件与处方因素进行了优化考察。采用乳化溶剂法制备纳米粒,通过MTT法考察体外抗肿瘤活性,采用透析法评价体外释药特性,建立可靠的含量测定方法及体内外质量评价指标,研究纳米给药系统在家兔体内的药物动力学特征及小鼠体内组织分布特征。主要研究结果如下:　　 1.采用乳化溶剂蒸发法合成PEI交联普朗尼克F127共聚物(F127/PEI)。首先利用羰基二咪唑(CDI)活化F127,然后利用PEI的分枝结构末端丰富的伯氨基,将大分子量的PEI(Mw25000)与活化的F127交联起来,从而制得在溶液中稳定存在的纳米粒。在结构表征中,对新型F127/PEI共聚物分别做了1H-NMR光谱测定和红外光谱测定。在1H-NMR光谱中,δ2.81ppm(-CH2NH-ofPEI),峰是PEI的特征峰；在其红外光谱中,3424cm-1为NH的伸缩振动吸收峰,1719cm-1为羰基峰,从而可确证F127/PEI共聚物的结构。　　 为了确定合适的F127与PEI的比例和制备工艺,以纳米粒形态及CMC值为指标,对处方进行优化,选择对纳米粒形态和CMC值有影响的四个因素作为考察对象,即Activated-F127与PEI质量比X1(m/m)、水相体积X2(mL)、旋转蒸发温度X3(℃)和乳化时间X4(min),,每个因素有3个水平,按均匀设计U9(34)表安排试验,根据纳米粒形态及CMC值的优化结果,得出最佳处方及工艺为:Activated-F127与PEI质量比为30,水相体积为20mL,旋转蒸发温度为50℃,乳化时间为3min。　　 叶酸介导的F127/PEI共聚物(Folate-F127)的合成,是在F127/PEI共聚物的基础上进行的,通过PEI富余的未与F127交联的伯氨基在EDC的催化下与叶酸反应,生成新型材料-Fa/F127/PEI共聚物(Folate-F127)。在结构表征中,对Folate-F127共聚物分别做了1H-NMR光谱和红外光谱测定。在Folate-F127共聚物的1H-NMR图谱中,出现了一系列叶酸的特征峰,它们分别为δ2.28ppm(C22-H2offolicacid),δ4.48ppm(C9-H2offolicacid),δ6.62ppm(aromaticprotonsoffolicacid),δ7.62ppm(aromaticprotonsoffolicacid),δ8.64ppm(C7-Hoffolicacid)；在其红外光谱中,在1531cm-1处出现了酰胺键的亚胺基峰,在1632cm-1处出现了酰胺键的羰基峰,由此可确Folate-F127共聚物的结构。通过紫外分光光度计测得共聚物中叶酸的含量,5％(或10％)叶酸介导F127/PEI共聚物中叶酸的含量为4.8％(或8.8％)(5％和10％是叶酸占F127/PEI共聚物中总伯氨基含量的摩尔比),此含量的叶酸能保证提供足量的叶酸受体激活轭合物。　　 2.对紫杉醇F127/PEI和叶酸介导的F127/PEI纳米粒的理化性质及体外释放试验进行了综合评价,所制备的该两种纳米粒在透射电镜下观察分散性好、圆整、均匀而不粘连。F127/PEI纳米粒,平均粒径为157.6nm,Zeta电位为-9.79±0.55mV,载药量为(0.57±0.10)％,包封率为(52.54±4.1)％；5％Folate-F127纳米粒,平均粒径为188.3nm,Zeta电位为-0.824±0.45mV,载药量为(1.01±0.09)％,包封率为(83.14±6.3)％。　　 体外释放试验结果表明,游离PTX的体外释药方程可用一级动力学方程描述,6h药物释放已达94％；F127/PEI-PTX和5％Folate-F127/PEI-PTX纳米粒的体外释放可用双相动力学方程拟合,其释药前期为快速释药,后期缓慢释药。这种释药特点比较符合抗肿瘤药物的用药原则,即纳米粒到达靶部位后可立即释放出较多药物,达到较高浓度发挥治疗作用,后期缓慢释出剩余药物,可使药物到达靶部位以维持有效药物浓度,能保持较长时间的治疗作用。　　 3.采用MTT比色法研究了不同活化F127和PEI比例合成的聚合物对HepG-2细胞的毒性。结果表明,细胞存活率随着PEI量的减少而增大。由于PEI较强的渗透作用,能破坏细胞的溶酶体膜,显示出细胞毒性。同时还研究了F127/PEI-PTX、5％Folate-F127-PTX和10％Folate-F127-PTX三种纳米粒及PTX溶液、Taxol注射液对人肝癌细胞HepG-2体外生长及增殖的影响,评价体外抗肿瘤活性。结果表明,与PTX溶液相比,三种纳米粒的抗肿瘤活性明显增强。其中,具有叶酸介导的纳米粒的抗肿瘤活性要强于Taxol注射液和F127/PEI-PTX纳米粒。F127/PEI-PTX、5％Folate-F127-PTX、10％Folate-F127-PTX、PTX溶液和Taxol注射液的半数抑制浓度(IC50)分别为:1.27±0.09,0.25±0.02,0.26±0.03,29.0±3.3,0.40±0.03μ/mL。由携带罗丹明B的纳米粒所进行的细胞(HepG-2肿瘤细胞)摄取实验中可得知,三种纳米粒在HepG-2肿瘤细胞中的蓄积程度均高于游离罗丹明B。其中,叶酸介导的纳米粒在细胞中的蓄积程度要高于非叶酸组。　　 4.在家兔体内药代动力学试验中,F127/PEI-PTX、5％Folate-F127-PTX纳米粒及Taxol注射液分别耳缘静脉注射给药后,血药浓度测定数据用3p97药代动力学软件处理,三种制剂均符合双室模型特征,药物动力学方程分别为C=0.1495e-0.9646t+0.0397e-0.057t,C=0.0766e-1.3087t+0.0251e-0.0502t,C=0.2065e-1.5240t+0.0585e-0.2866t。F127/PEI-PTX和5％Folate-F127-PTX纳米粒的AUC值(0.9220mg/L*h和0.5748mg/L*h)明显高于Taxol注射液的AUC值(0.3446mg/L*h)；两种纳米粒的MRT(7.1734h和7.8864h)高于Taxol注射液的MRT(1.7524h)；两种纳米粒的机体总清除率CLs(0.0012L/h/kg和0.0018L/h/kg)均小于Taxol注射液的机体总清除率CLs(0.0030L/h/kg)。结果证明F127/PEI-PTX和5％Folate-F127-PTX纳米粒静脉注射给药后,可显著延长药物在体内的滞留时间,具有缓释长效作用。　　 5.由小鼠体内组织分布试验表明,F127/PEI-PTX、5％Folate-F127-PTX纳米粒及Taxol注射液分别尾静脉注射后,药物在各组织器官的分布发生了改变。结果显示,F127/PEI-PTX纳米粒组肺的总靶向效率Te由原来的18.79％(Taxol注射液组)提高到37.09％(1.97倍),其相对摄取率re和肺内峰浓度比Ce分别为2.9587和1.9251；5％Folate-F127-PTX纳米粒组肺的总靶向效率Te由原来的18.79％(Taxol注射液组)提高到56.80％(3.02倍),其相对摄取率re和肺内峰浓度比Ce分别为4.0004和2.7210。另外,5％Folate-F127-PTX纳米粒组对肺的靶向性要高于F127/PEI-PTX纳米粒组。将药物制成纳米粒后具有明显的肝、肺靶向性。