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青枯病是由茄科雷尔氏菌引起的世界范围内的细菌性病害,对包括马铃薯等多种作物造成巨大的危害。青枯菌体内含有众多毒力因子,其中三型效应蛋白是其致病的关键因子。本课题拟通过研究青枯菌效应蛋白干扰植物免疫的功能,挖掘马铃薯潜在的抗病机制。本研究对青枯菌效应蛋白Rip56进行了毒力鉴定,并利用遗传转化体系获得Rip56的转基因株系,并鉴定了其对马铃薯先天免疫通路的作用。此外,也研究了效应蛋白Rip6对马铃薯钙调信号通路的作用,揭示了钙调蛋白对青枯菌抗性作用。本研究为马铃薯青枯病抗病育种提供了理论依据。本研究主要包括以下5个方面:1.效应蛋白Rip56的毒力功能鉴定。利用野生型菌株UW551、突变体ΔRip56和突变体Δhrcv对野生型马铃薯Solanum chacoense(C9701)进行接种鉴定,结果显示:与野生型UW551相比,突变体ΔRip56的致病力显著下降,表明效应蛋白Rip56对于野生型马铃薯Solanum chacoense(C9701)具有显著的毒力作用。同时,在烟草叶片瞬时超量表达效应蛋白Rip56,在烟草叶片上能够产生细胞死亡的表型。并且,沉默免疫通路的关键基因NbNDR1、NbSGT1、NbNTF6、NbEDS1、NbRBOH、NbMEK2和NbMEK1无法干扰Rip56介导的烟草细胞死亡。2.效应蛋白Rip56转基因株系的构建。通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系成功转化了栽培种马铃薯Solanum tuberosum E3。获得了青枯菌效应蛋白Rip56转基因株系8个。通过阳性检测后,选取转基因株系Rip56-4、Rip56-6和Rip56-7进行后续免疫通路鉴定。3.效应蛋白Rip56转基因株系的表型鉴定。结果显示,转基因株系的植株生长高度与长势与野生型并无显著性差异,但抗病鉴定结果显示,效应蛋白Rip56的转基因株系对青枯菌UW551的抗性要高于对照E3,暗示效应蛋白Rip56激活了栽培种马铃薯Solanum tuberosum E3抗病相关通路。4.Rip56转基因株系PTI免疫通路的鉴定。活性氧实验表明,转基因株系中活性氧的迸发与野生型无显著差异,而PTI标记基因StPTI5具有显著上调表达;为了进一步验证StPTI5激活的免疫反应,对PTI5上下游的关键基因进行了检测,结果显示:蛋白激酶StPTO、转录因子StPTI5和基础防卫基因StPR1的表达被显著提高,该通路与前人报道的无毒因子AvrPTO激活的免疫通路相似,暗示Rip56可能通过激活该通路而提高了栽培种马铃薯Solanum tuberosum E3的青枯病抗性。5.效应蛋白Rip6抑制马铃薯钙信号通路。效应蛋白Rip6是一个毒力蛋白,转录组数据显示Rip6能够显著下调钙调蛋白的表达。接种实验结果显示,与效应蛋白突变体ΔRip6相比,野生型菌株的确抑制了钙调蛋白基因StCML5、StCML23、StCML-CAST、StCDPK2和StCNGC1的表达。同时构建了StCML5、StCML19、StCML23、StCML-CAST和StCDPK2基因的超量表达载体和Solanumtuberosum E3转基因株系,获得了StCML-CAST转基因植株并进行接种实验,结果表明,超量表达StCML-CAST转基因株系能够显著提高Solanum tuberosumE3对青枯菌UW551的抗性。本研究初步研究了Rip56的毒力功能,发现Rip56蛋白能够激活Solanum tuberosum E3对青枯菌的抗性作用,并发现该抗性作用是通过蛋白激酶PTO、转录因子PTI5和基础防卫基因PR1进行介导的;此外本研究还验证了效应蛋白Rip6对钙调蛋白的转录调控作用,发现超量表达钙调蛋白基因StCML-CAST能够提高马铃薯青枯病抗性,为马铃薯青枯菌抗性遗传改良奠定理论基础。