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目的肠神经元异常性疾病（Neuronal intestinal malformation,NIM）是一类肠神经分布、质量异常导致肠功能障碍而影响人们健康的常见疾病,主要临床表现为慢性便秘、小肠结肠炎等。以往研究集中在先天性发育障碍导致的无神经节细胞症即先天性巨结肠（HD）及巨结肠类缘病（HAD）,已有报道先天性肛门直肠畸形（anorectalmalformation,ARM）患儿的肠神经系统（enteric nervous system,ENS）发育也存在异常,近年来发现年长儿及成年后有肠神经元异常改变,缺血、感染、毒素等因素导致肠神经变性可能是后天性肠神经元异常的重要因素。究竟如何出现ENS异常,一直是医学领域探究热点,病因机制至今仍不明确。近期动物实验发现骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）在鼠胚胎期器官发育和神经发育过程中起重要作用。本课题应用免疫组化、PCR以及Western blot技术研究血管内皮生长因子（VEGF）与BMPs在人类NIM肠管表达,探讨在ENS发育过程中可能的作用,并进行缺血与神经病变相关性研究。通过建立肠神经元异常大鼠模型,应用常规HE染色观察大鼠结肠远端神经节的病理性改变,检测其肠组织和神经组织中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽及总抗氧化能力等脂质过氧化指标变化,以期为揭示NIM的病因与发病机制奠定基础。方法本研究标本取自山东大学附属医院外科,2006～2008年经病理证实的62例NIM患者。其中HD狭窄段为无神经节细胞段,移行段为查见有神经节细胞段,扩张段为接近神经节细胞正常段。分别取两份新鲜标本放入无菌试管置于-80℃冰箱中保存,另取一份用10%福尔马林固定,常规行蜡块包埋HE染色。按不同年龄分为新生儿组、幼儿组及年长组,并选无肛肠疾病32例为正常对照组。分别对NIM病变段及正常段肠壁组织进行HE常规染色及免疫组织化学染色,使用RSImage成像系统照相并存盘,利用图像分析软件判定VEGF,BMP—2,BMP—4阳性染色面积,用SPSS17.0统计分析软件单因素方差分析分别对VEGF,BMP平均光密度（MOD）分析比较;用实时荧光定量PCR技术对目的蛋白在病变段及正常段肠壁组织的表达从基因水平定量分析,对VEGF基因,BMP—2,BMP—4基因及内参基因的Ct值采用7500型SDS应用软件计算相对定量2-ΔΔCt比较表达差异;用Western blot技术对VEGF,BMP—2,BMP—4的表达从蛋白水平进行定量分析。Wistar雄性大鼠（体重为180～220g,由山东大学实验动物中心提供）随机分为两组,即实验组（n=40）和相应时间匹配的对照组（n=50）。为确定肠神经病变和脂质过氧化的变化,二硫化碳（CS2）吸入按大鼠1250 mg/m3持续12周,对照组给予相同剂量的空气。分别在0、2、4、8和12周,从对照组和实验组随机取10只大鼠,迅速取出肠组织、大脑、海马和脊髓神经组织,投入液氮中-80℃储存备用。打开大鼠腹腔后取结肠远端2cm肠管,10%甲醛溶液固定、编号,待组织观察。蛋白含量由专用蛋白定量试剂盒测定,分别测定大鼠肠组织、大脑皮质、海马、脊髓和血清中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化能力的变化。所有的脂质过氧化指标均在实验组和对照组分别测定。结果1.免疫组织化学结果阳性染色点为棕黄色颗粒,VEGF主要分布于粘膜腺体、粘膜下血管区及肌层,神经节内亦可见到。BMP在粘膜层、粘膜下层及肌层均可见表达,在肠神经节细胞胞质内也有表达,从粘膜层到肌层呈梯度递减。粘膜层、粘膜下层腺体及基底膜连续黄染,平滑肌呈纤维网状,病变段可见点状棕黄色颗粒,正常段黄染明显加强。BMP-2与BMP-4染色强弱分布趋势基本一致。对平均光密度分析比较,VEGF在病变表达比正常段明显降低（P＜0.05）,从正常段到病变段递减。BMP-2,-4在病变表达比正常段明显降低（P＜0.05）,在各段肠管纵肌、环肌和粘膜肌层平滑肌细胞中表达差异无统计学意义（P＞0.05）。在HD移行段、狭窄段神经节细胞内的分布与正常对照组相比差异有显著性意义（P＜0.05）,呈不同程度的降低,但在扩张段与正常对照组比差异无统计学意义（P＞0.05）。在其余各组病变段与正常对照差异均有统计学意义（P＜0.05）。BMP-2及BMP-4分布表达趋势基本一致。各年龄组中在狭窄段、移行段分别与扩张段比差异有显著性意义（P＜0.05）,不论年长组还是幼儿组正常段,与新生儿组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,但不同年龄组狭窄段、移行段与新生儿组间差异无统计学意义（P＞0.05）。2.实时荧光定量PCR结果VEGF,BMP—2,BMP—4基因在HD狭窄段表达分别是扩张段的0.09倍,0.07倍、0.19倍,移行段是扩张段的0.21倍,0.22倍,0.33倍,从扩张段至狭窄段逐渐减低。年长组较新生儿组正常对照基因表达差异均有统计学意义（P＜0.05）,随年龄增长表达均呈下降趋势,表达同时具有空间位相性与时相性。VEGF与BMP-2,-4基因表达呈正相关（r=0.586,r=0.621,P＜0.01）,BMP-2与BMP-4的表达也呈正相关（r=0.762,P＜0.01）。其余各组病变段与正常对照同样差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.Western blot结果VEGF,BMP—2,BMP—4蛋白在HD移行段、狭窄段表达呈不同程度的降低,与正常段比差异均有显著性意义（P＜0.05）。在扩张段表达与正常段差异无统计学意义（P＞0.05）。VEGF,BMP—2,BMP—4蛋白在年长组、幼儿组扩张段表达较新生儿组表达下调,差异具有统计学意义（P＜0.05）,目的蛋白表达同样具有空间位相性与时相性。4.肠神经病变大鼠脂质过氧化的变化实验组大鼠结肠HE染色显示肠神经节体积膨胀,胞浆染色变淡,出现空泡样变性,甚至细胞数量减少。ROS含量在肠组织、大脑皮质、海马、脊髓和血清中明显升高。肠神经中2、4、8和12周分别升高了11.8%、34.9%、38.5%和42.7%（P＜0.01）,大脑皮质中4、8和12周分别升高了19.0%、30.5%和31.55%,脊髓中在8和12周分别是对照组的134.7%和164.4%,与对照组相比血清中ROS含量在4、8和12周分别升高了71.9%、85.3%和87.9%（P＜0.01）。肠组织MDA含量在2、4、8和12周分别升高了33.3%、52.4%、66.7%和76.2%（P＜0.01）,大脑皮质分别增加到相应对照组的117.1%、122.2%、128.6%和134.8%,血清也显示分别升高了14.0%、19.0%、33.0%和53.6%（P＜0.01）。实验组肠组织、大脑皮质、海马、脊髓和血清中GSH-Px活性明显降低,12周后分别下降24.8%、18.2%、29.9%、16.2%和33.3%。GSH、CAT和T-AOC活性也下降,GSH含量和CAT、T-AOC活性在肠神经分别在4、2和4周开始下降,大脑皮质中8、8和2周开始下降,海马中在8、2和2周降低,脊髓中-、8和8周下降（-表示无变化）,血清中在8、4和8周降低。12周后GSH含量和CAT、T-AOC活性在肠组织下降9.1%,20%,19.4%;大脑皮质中分别下降15.2%、22.6%和23.6%;在海马中分别下降25.6%、46.4%和32.3%;在脊髓中分别下降-2.2%（P＞0.05）,35.0%和15.5%;血清中分别下降16.3%、48.6%和30.7%。但是SOD活性升高,12周后在肠组织、大脑皮质、海马、脊髓和血清中升高20.8%、31.5%、44.4%、64.4%和12.1%（P＜0.01）。实验组大鼠肠组织、大脑皮质、海马、脊髓和血清中活性氧、丙二醛的含量明显增加,并有明显的时间依赖性。在2、4、8和12周谷胱甘肽浓度和谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性均明显下降,总抗氧化能力也明显降低。氧化应激同时也导致了神经组织中Ca2+浓度和钙调蛋白含量明显升高。结论VEGF、BMP—2,—4在人类ENS中存在表达,在NIM病变肠管表达异常,呈现明显降低,年长组较新生儿组表达呈下降趋势,表达同时具有时相性与空间位相性。目的蛋白的表达是内在的,可能参与引起肠壁神经嵴细胞（NCC）过早分化、迁移、成熟导致IGC异常,提示与NIM发生的发病有关,两者表达又互相影响呈正相关,对NIM形成可能存在内在的联系。实验组大鼠肠神经节形态学异常,其肠组织中活性氧、丙二醛的含量明显增加,过氧化增强同时抗氧化能力降低,表明脂质过氧化可能对抗BMP引起神经损伤,至少部分介导了肠神经异常的发生。