鸡传染性支气管炎病毒（IBV）属于冠状病毒科,是鸡传染性支气管炎（IB）的病因,是造成养鸡业严重经济损失的主要原因之一。N蛋白是IBV重要蛋白之一,N蛋白在IBV的复制和组装中起着极其重要的作用,影响其免疫原性,参与细胞免疫反应,在IBV的诊断和新型疫苗的研发中,N蛋白是一种重要的靶蛋白。噬菌体展示技术作为一种新基因工程技术,可通过对特定病原（蛋白）的生物挑选和鉴定,在抗原表位分析、新型药物与疫苗研制和疾病诊断等方面都已成功应用。本研究主要通过噬菌体展示技术筛选出与重组蛋白pET-30a-N能够特异性结合的亲和肽,并对其在体内和体外抑制病毒感染的作用进行探究,为IBV抗原表位和小分子多肽抗病毒制剂的研究提供理论和实验基础。首先,原核表达并纯化pET-30a-N重组蛋白。本实验用的是实验室之前已构建成功的重组质粒pET-30a-N,IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE验证表达成功后进行重组蛋白的纯化,并进行蛋白透析。最后再通过SDS-PAGE方法对纯化透析后的重组蛋白进行检测。结果显示,在本实验中pET-30a-N重组蛋白成功表达并且纯化后得到较为单一的条带。其次,进行pET-30a-N重组蛋白亲和多肽筛选。按照噬菌体十二肽展示技术说明书,以纯化后并具有生物活性的重组蛋白pET-30a-N为靶分子,进行四轮生物活性淘选,在第四轮生物淘选完成后,在平板上随机挑选30个噬菌斑进行扩增,扩增之后对这30个噬菌斑进行DNA的提取并进行亲和多肽基因的扩增纯化,测序后推导出其相应的氨基酸序列。结果显示,一共获得8种特异性较高的氨基酸序列,选择其中出现次数多且特异性较高的三个序列进行合成,三个多肽分别为G肽（GNNPLHVHHDKR）、H肽（HHFRHGHLDLLT）和Q肽（QVNGLGERSQQM）。通过ELISA法测定这三种多肽对应的亲和噬菌体能够与IBV发生特异性结合,IBV稀释到6.0 TCID50/m L时,G肽和H肽两种亲和噬菌体仍然呈现阳性反应,而与IBDV、ALV、NDV、ILTV这4种鸡源病毒无交叉反应,说明这三种多肽对IBV的特异性和敏感性良好。利用体外实验,检测G、H和Q肽抑制IBV感染CEK细胞的水平。采取MTT法确定3种多肽对CEK细胞的最大无毒浓度,测定最大无毒浓度为1 mg/m L。然后通过应用不同的孵育方法对三种多肽的作用方式进行筛选,结果显示多肽与病毒一起孵育2 h后再作用于CEK细胞的方式抗病毒效果最好,此种方式孵育的G和H肽对IBV感染CEK细胞的抑制率分别达到63%和56%,并以此种方式进行间接免疫荧光实验,同样观察到G和H肽体外抑制病毒作用优于Q肽。检测G、H和Q肽相应亲和噬菌体体内抑制IBV感染鸡的作用。75只14日龄鸡随机分成五组:Low LB组、G组、H组、Q组、IBV感染组。14日龄时,Low LB组的鸡口服灭菌后的Low LB培养液,G组、H组、Q组、IBV感染组的鸡口服100 TCID50IBV。同时,分别给G、H和Q组口服1×1012 pfu所对应的噬菌体。于感染后第3、5、7、10和14天进行剖检采取气管、肺脏和肾脏,测定各组鸡的体重变化、大体病理变化、组织病理学变化和各器官病毒载量变化。实时荧光定量PCR结果显示,在感染后7 d,鸡的气管、肾脏和肺脏组织中病毒复制出现高峰,并且G、H和Q组都明显低于攻毒组,其中G和H组又低于Q组。组织病理学等结果表明,相比IBV感染组,G和H组鸡的气管、肺脏和肾脏大体和组织学病理学变化都明显减轻,而Q组未见比较明显的抑制效果。利用Autodock软件对pET-30a-N重组蛋白和三种多肽进行分子对接。通过Swiss-model网站对pET-30a-N重组蛋白构建出结构模型,并通过Autodock软件对G肽、H肽和Q肽分别分析和pET-30a-N蛋白的对接情况。结果显示,三种亲和肽G肽、H肽、Q肽与pET-30a-N重组蛋白之间均具有疏水力和氢键力,其中G肽和H肽与pET-30a-N重组蛋白结合作用最好,Q肽与pET-30a-N重组蛋白的结合能力很弱。综上所述,本实验证明pET-30a-N重组蛋白的两种亲和多肽G肽和H肽在体内外均能有效的抑制IBV的感染,为小分子多肽制剂抑制IBV感染的研究提供了重要的理论和物质基础。