一.背景：针刺麻醉是中医针灸学在现代科学技术条件下的重大发展和突破。针刺镇痛(acupuncture, AA)作为针刺麻醉的核心组成部分,持续多年都是国内外医学研究的热点。大量神经生物化学、组织病理、受体放射性配基结合分析等研究揭示,针刺作为一种刺激镇痛疗法,通过激活脑内与痛觉有关的结构实现镇痛,是多种神经递质(包括神经肽)及受体共同参与下的生理过程,其中,内源性阿片肽与阿片受体(opiate receptors, ORs)是参与AA的主要神经化学物质。但由于目前多数研究仅限于动物实验,基于人体的作用机制至今尚未阐明。近10多年,功能磁共振和正电子发射断层扫描(positron emission tomography, PET)等影像技术的发展,为针刺基于人体的穴位特异性和镇痛中枢机制研究提供了直接、客观的有力手段。PET受体显像依据受体-放射性配基特异性结合的特性实时观察活体内微量受体的存在和变化,以无创性的方法获得受体的分布(定位)、数量(密度)和功能(亲和力)影像,具有独特的显像优势。将PET受体显像技术应用于针刺研究,对于阐明AA的中枢机制和促进针刺麻醉的科学应用都将具有重要意义。理想的放射性配基是开展PET受体显像的关键。本课题为国家重点基础研究发展计划(973计划)中医理论专项——“基于针麻开颅的针刺镇痛机制研究”子项目,旨在通过对μ-ORs正电子配基11C-卡芬太尼(carfentanil, CFN)的放射性制备、质量控制以及大鼠体内分布研究,从而建立应用国产11C模块在线自动化制备11C-CFN的方法,评价其物理、化学和生物学性质,为AAμ-ORs PET显像临床试验的开展做好前期准备。二.内容：目的：建立应用国产11C模块在线自动化制备μ-ORs PET显像剂11C-CFN快速有效的方法。方法：11C-碘代甲烷(CH3I)在线转化为11C-三氟甲基磺酰甲烷(Triflate-CH3I),后者通入装有0.5 mg前体去甲基CFN(溶解于0.15 ml二甲基亚砜溶液)的V型瓶内,分次在常温(n=12)、冰浴(n=2)、加热(55℃,2min,n=3)条件下对前体进行甲基化反应并完成11C标记。粗产品用3 ml二元体系溶液(异丙醇/氨水)转移至Sep-PakC2柱,先后用10 ml×3注射用水淋洗C2柱,再经氮气(10ml/min×3 min)吹干后,用0.5 ml无水乙醇将11C-CFN从C2柱洗脱下来。另称取1.0 mg前体置于常温下反应(n=3),计算产率。结果：应用国产11C模块在线自动化制备11C-CFN合成时间约20 min(加速器轰击结束,EOB)。0.5 mg前体常温下反应平均产率为(35.5±2.2)%(n=12,不校正)；冰浴下产率明显降低,为(5.7±2.3)%(n=2)；加热时产率(34.9±3.7)%(n=3)。1.0 mg前体常温下反应产率为(36.8±3.9)%(n=3)。11C-CFN的纯化不需经高效液相色谱仪(HPLC)分离。目的：应用分析型HPLC进行11C-CFN鉴定,建立11C-CFN的物理、化学、生物学性质等质量控制标准,小鼠毒性试验评价药物的安全性。方法：11C-CFN的鉴定采用分析型HPLC检测系统：固定相Xterra RP 18柱(5μm,3.9×150 mm, Waters);流动相V(乙腈)：V(水)V(0.02 mol/L乙酸铵)=55：45：0.1,pH值6.5；流速0.5 ml/min;紫外检测波长224 nm. 11C-CFN的质量控制参考美国药典正电子药物标准和国家食品药品监督管理局制定的《正电子类放射性药品质量控制指导原则》执行。12只KM小鼠随机分为试验组与对照组进行11C-CFN毒性试验,观察尾静脉注射一定负荷量的11C-CFN与等体积的10%乙醇溶液后小鼠的反应,常规饲养一周后送检主要组织脏器病理。结果：11C-CFN的紫外保留时间(Rt)为5.0 min,放射峰Rt为5.1 min,与CFN标准品Rt(5.1min)一致。产品中未探测到明显的前体去甲基CFN及其他杂质峰。11C-CFN注射液澄清、透明、无沉淀,pH值6.5-7.0,放化纯度>98%,放射性浓度9.2mCi/ml,放射性半衰期T1/2=20±2min,比活度0.75 Ci/umol,乙醇含量<10%,滤过膜透过压力≥0.4Mpa,细菌学及内毒素试验检测阴性。小鼠毒性试验验证CFN强效的阿片类效应。目的：了解11C-CFN在大鼠体内各组织脏器的分布特点,评价11C-CFN与脑内μ-ORs结合的特异性和可饱和性。方法：12只SD大鼠随机分为4组,每组3只,每只尾静脉注射11C-CFN 11.1MBq/0.2ml。分别于注射后5、15、30、45 min分组处死大鼠,迅速采血,分离脑、心、肝、脾、肺、肾、小肠,快速称重和测量放射性计数,计算经衰变校正后不同时间段每克组织器官百分注射剂量率(percentage activity of injection dose per gram of tissue,%ID/g)。纳洛酮预处理进行ORs阻断后观察各脑区放射性分布变化。结果：11C-CFN静脉注射后5 min,大多数组织脏器放射性分布达峰值,肝、肾的放射性摄取最高,分别为(6.19±3.11)%ID/g、(9.03±2.36)%ID/g,之后3个时段内,肝脏摄取进一步升高,肾脏逐步下降。血液中放射性清除迅速,脑组织摄取相对较高[(3.21±0.77)%ID/g],脑／血比值在注射后5-45 min内为1.82-1.39。各脑区中丘脑[(4.26±0.89)%ID/g]和纹状体[(4.05±1.08)%ID/g]的摄取最为显著,其次分别为大脑皮质[(2.63±0.89)%ID/g]、脑干[(2.26±0.57)%ID/g]、海马[(2.17±0.55)%ID/g]和小脑[(2.15±0.39)%ID/g]。丘脑的放射性清除最为缓慢,小脑最快。纳洛酮预处理后,各脑区的放射性分布显著下降,其中丘脑与纹状体分别较对照组下降74.3%、78.9%。三.结论：1.本研究首次在国内进行ORs PET显像剂的放射性制备研究。研究结果显示,应用国产11C模块在线自动化制备11C-CFN简便快速、产率稳定、放化纯高,主要质量控制指标符合使用要求。2.与以往报道的11C-CFN标记工艺及产品的纯化方法相比,本研究主要的特点有：①在产率不降低的前提下,前体用量减少了50%(1.0 mg减少至0.5 mg),显著节约了经济成本；②不使用强碱作反应介质；③淋洗液中氨水含量较少(体积分数1%,3 m1),产品的pH值更接近中性；④无需经阴离子交换柱过滤,产品放化纯便可>98%,制备流程进一步简化。3. 11C-CFN在体内吸收迅速、分布广泛,主要通过肝、肾代谢,血液中清除迅速,脑内摄取高。各脑区中,丘脑和纹状体等已知μ-ORs分布最为密集的部位呈现显著摄取、缓慢清除的特点,与11C-CFN对μ-ORs选择性结合的作用机理相符合。纳洛酮预处理可有效阻断11C-CFN在各脑区的分布,验证了11C-CFN与g-ORs结合的可饱和性。4.未来期望通过小动物PET (Micro-PET)显像的开展,对传统的药物体内分布试验(%ID/g)与动物活体内显像结果进行对照研究,同时探索可行性高的受体结合分析方法。5.CFN是强效的μ-ORs激动剂(>吗啡的生物学效应7000倍),剂量控制不当可诱发昏迷和呼吸抑制。为了更安全地用于人脑显像,有必要进一步提高产品的比活度。