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目的:本实验通过四血管阻断法制备大鼠全脑缺血再灌注模型,在此基础上运用鼻咽腔降温法对大鼠进行头部浅低温,并应用线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的开放剂苍术苷在大鼠全脑缺血前进行侧脑室注射,来观察再灌注期间大鼠海马MPTP的开放情况,海马CA1区细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)蛋白、 Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达。研究头部浅低温对全脑缺血再灌注损伤大鼠MPTP及细胞凋亡的影响,进一步探讨浅低温脑保护的作用机制,为以后临床治疗脑缺血再灌注损伤疾病提供新的理论依据。 方法: 1、实验分组 体重250~300g的健康雄性清结级SD大鼠72只(由河北医科大学实验动物中心供应)。将大鼠随机分成6组(n=12):假手术组(S组)、全脑缺血/再灌注组(IR组)、低温组(H组)、苍术苷组(A组)、低温+苍术苷组(HA组)、低温+生理盐水组(HN组)。 2、全脑缺血再灌注模型制备 制备大鼠全脑缺血再灌注模型应用的是改良的Pulsinelli四血管阻断法。大鼠常规禁食8小时,无需禁水,称重后10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯卧固定于动物实验台,于颈后正中第一、二颈椎处剪毛消毒后切开皮肤,逐层分离,暴露双侧翼小孔。用自制电烙铁烧灼两侧翼小孔内椎动脉使其永久闭塞,缝合皮肤。24 h后相同方法麻醉大鼠,仰卧固定于实验台上,气管插管保留自主呼吸吸氧,颈前正中剪毛消毒切开皮肤,分离双侧颈总动脉,穿线备用。此过程中,大鼠间断吸入七氟醚维持麻醉,尾静脉穿刺置管持续泵入乳酸钠林格氏液维持循环。 3、实验处理及监测 大鼠全脑缺血时间为15min,再灌注24 h。不同组给予不同处理: S组作为假手术组只暴露双侧翼小孔,不烧灼椎动脉;只分离颈总动脉,不对其夹闭。其它五组都烧灼椎动脉夹闭颈总动脉,制成全脑缺血再灌注模型。其中,H组、HA组和HN组进行低温处理:在大鼠气管插管后,咽喉部气管插管旁置入棉球和吸痰管(低温过程中持续吸引)以防止误吸,双侧鼻腔置入20G硅胶管,深度约为20 mm,持续泵入4-5℃的冷盐水,速度为100 ml·min-1·kg-1,实施头部浅低温,等到海马温度降至(33.0±0.5)℃后,双侧颈总动脉闭塞15 min,低温维持1h后保持自然复温。HA组和A组于再灌注前10 min苍术苷15 ul左侧脑室缓慢注射。HN组左侧脑室注射等量生理盐水。术中监测脑电图(头皮刺入电极)、心电图(四肢皮下刺入电极)、海马温度(温度探头置入右侧海马CA1区即前囟后3.6 mm、中线右旁开3 mm和皮层下2 mm)以及直肠温度(维持在37.0±0.5℃)。 4、标本制备及检测 4.1紫分光光度仪检测海马MPTP开放情况 再灌注24 h后,每组取6只大鼠进行麻醉(10%水合氯醛腹腔注射),然后迅速断头分离出海马组织,根据线粒体提取试剂盒说明提取海马线粒体,整个过程均在0~4℃下完成。提出的线粒体用于MPTP开放情况的检测。 4.2免疫组织化学法测定海马CA1区Cyt C蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达 每组取另外6只大鼠麻醉成功后,用4%多聚甲醛迅速经心灌流固定,固定后快速断头取出脑组织并继续固定于4%多聚甲醛中,然后放入4℃冰箱中保存,用于免疫组织化学检测。 结果: 1、六组大鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。 2、大鼠海马神经元MPTP开放程度的比较 与S组相比,其余各组MPTP吸光值减少程度均增大,MPTP开放程度增加(P<0.05);与IR组比,H组、HA组和HN组MPTP吸光值减少程度降低,MPTP开放程度减小(P<0.05);与H组比较,HA组MPTP吸光值减少程度增加,MPTP开放程度增加(P<0.05)。 3、大鼠海马CA1区Cyt C蛋白的比较 与S组相比,其余五组Cyt C蛋白表达均增多(P<0.05);与IR组相比,H组、HN组和HA组Cyt C蛋白表达均减少(P<0.05);与H组相比,HA组Cyt C蛋白表达增多(P<0.05)。H组和HN组、IR组和A组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 4、大鼠海马CA1区Bax、 Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax的比较 与S组比较,其它五组Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达均增加,H组和HN组Bcl-2/Bax比值升高,IR组和A组Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05);与IR组比较,H组和HN组Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达减少、Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05);与H组和HN组比较,HA组Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增多、Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。H组和HN组比较、IR组和A组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1、头部浅低温可有效减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤,抑制细胞凋亡,有神经保护作用。 2、头部浅低温的脑保护作用机制与抑制海马细胞MPTP的开放有关。