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诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells或iPSCs)不仅具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)相似的无限再生能力和分化能力,而且取材容易、操作简单、避免了伦理学限制。因此,iPS细胞的研究不仅具有重要的理论意义,而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。iPS细胞的产生过程即重编程的过程。然而,在传统的iPS细胞产生过程中,病毒载体和整合到基因组内的外源基因会导致iPS细胞具有致癌性,这一点极大地限制了 iPS细胞的应用。近十年来,科学家们利用非病毒载体得到了无外源基因的iPS细胞,但是这些iPS细胞的多能性尤其是种系传递的能力没有得到严格的检验。在前人研究的基础上,本研究构建了三个携带不同重编程因子的episomal质粒:pMasterl、pMaster3和pMaster12,每个pMaster质粒均携带正筛选标记neo和负筛选标记HSVtk。利用这三个质粒分别转染Oct4-GFP小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEFs),经过正、负筛选均得到了 iPS细胞。进一步PCR检测发现,pMasterl诱导的iPS细胞外源基因OKSM难以去除,pMaster3诱导的iPS细胞外源基因NR5A2难以去除,而pMaster12诱导的8株iPS细胞系(iPSZX1 1-3-1、iPSZX1 1-3-2 和 iPSZX1 1-18-2 等)均是不含有外源基因的。其中,iPSZX1 1-18-2形态和ES细胞相似,具有正确的核型,能够表达多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Sseal,并且能够成功生成嵌合体和生殖系嵌合体。为了探究重编程的机制,本研究对不同质粒诱导的、不同培养基中培养的iPS细胞进行表达谱芯片分析,发现与pMasterl和pMaster3相比,pMaster12诱导的iPS细胞最接近ES细胞;与胎牛血清培养基相比,2i培养基能有效地抑制细胞分化。深入研究pMaster诱导的iPS细胞发现,外源基因难以完全去除很可能是内源重编程不充分导致的。因此,为了改进这项技术、更好地理解重编程机制,本研究在全基因组水平上建立了高通量筛选重编程相关基因的方法。该筛选法以三因子组合OKS(Oct4、Klf4和Sox2)作为敏感的筛选背景,以piggyBac(PB)转座子质粒pFind1作为筛选质粒,首先进行小规模的筛选。在挑取的300个OKS/pFind1诱导的iPS细胞克隆中筛选到了 213个基因,其中包含有已知的重编程基因如Nr5a1、Klf5和miR205等;qRT-PCR结果显示,pFind1能上调整合位点附近基因mRNA的表达,调控范围达到120 kb。单克隆的挑取和鉴定费时费力,因此结合二代测序技术(next gen-eration sequencing,NGS)进一步设计了高通量鉴定 pFind1 整合位点的方法。本研究收集了 50万个OKS/pFind1诱导的iPS细胞克隆,通过NGS和生物信息分析,绘制了 pFind1在21条染色体上的整合频率图谱,并在pFind1整合位点附近找到了 12634个基因。根据每个基因附近100 kb区域内pFind1整合的频率对这些基因进行排名,绘制了基因排名表。通过基因本体论分析和信号通路聚类分析发现,被pFind1破坏的基因很多与细胞分化相关;被pFind1激活的基因很多聚类到先天免疫的通路上。最后,本研究在基因排名表中选取了 10个基因,并对这10个基因的重编程的相关性进行鉴定,发现这些基因能不同程度地促进重编程,排名高的基因作用更为显著,这说明基因的排名为评估基因的重编程相关性提供了重要的参考。综上所述,本研究建立的无外源基因的小鼠iPS细胞系为iPS细胞在再生医学领域的应用奠定了基础;本研究建立的高通量筛选法,在其它生物学过程的分析方面也具有广泛的应用前景。