鸽新城疫病毒分离鉴定与油乳剂灭活疫苗研制

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随着养鸽业向规模化、集约化方向发展,鸽的疾病不断出现,其中以鸽新城疫最为严重和普遍。鸽新城疫(Pigeon Newcastle Disease),俗称鸽瘟,是由鸽1型副粘病毒(PPMV-1)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。鸽群常突然发病,迅速蔓延,其临床症状主要表现为出血、腹泻和神经症状,尤以嗜神经速发型为多见,发病率和死亡率都很高,感染鸽死亡率达30%~60%,严重的可达80%以上,对养鸽业造成巨大威胁。该病不仅给养禽业带来了重大损失,同时给我国的禽产品出口造成了影响。自上世纪八十年代以来,由于疫苗的广泛使用,新城疫已由过去大面积的爆发转变为零星散发,临床症状也由过去的典型变成非典型。由于鸽1型副粘病毒对鸽有很强的致病性,单纯使用鸡新城疫疫苗不能产生完全有效的免疫保护,免疫过鸡新城疫疫苗的鸽场仍有鸽新城疫发生的报道。本研究通过对自己分离的鸽新城疫JSG分离株的系列生物学特性、血清学特性研究,在研究结果的基础上开展了油乳剂灭活疫苗的研制,以期为有效预防和控制鸽新城疫作出贡献。   本研究从南京六合某养鸽场疑似鸽新城疫的鸽群中,采集具有典型新城疫症状和病理变化的病死鸽脑组织,分离到一株病毒,命名为JSG株。对其进行了SPF鸡胚接种试验,分离株HA及抗NDV血清HI试验,MDT、ICPI和IVPI、ELD50,回归健康鸽试验及负染透射电镜形态学观察等毒力学指标测定及部分理化特性的试验。结果表明:该分离株电镜下呈球形,有囊膜,大小不一,但直径大多为200 nm左右,似副粘病毒的形态结构;回归试验鸽出现典型的鸽新城疫临床症状和病理变化;病死鸽的脑组织及回归病死鸽脑组织接种10日龄SPF鸡胚后,于40~56小时内死亡,死亡胚尿囊液血凝价达6log2,死亡胚体血凝价达5log2,能被NDVLasota株阳性血清中和,HI效价为8log2;MDT为80h、ICPI为1.225、IVPI为0.43、ELD50为10-7.66(0.1ml);分离株对56℃水浴、4.8%的氯仿、pH3均较敏感。证明该分离株为鸽新城疫病毒毒株。为将该分离毒株制备成油乳剂灭活疫苗,我们进行了分离毒株抗原液的制备、抗原灭活条件的试验、疫苗乳化工艺的研究、疫苗安全性的检验及不同免疫途径的免疫效果试验、不同免疫剂量的免疫原性试验、疫苗免疫保护试验、与商品化的鸡新城疫油乳剂灭活疫苗免疫效力对比试验及区域扩大试验等,结果表明:将鸽新城疫病毒JSG株鸡胚毒以1:10000倍稀释,接种于9~10日龄鸡胚尿囊腔,0.1ml/胚,收集24~96h内死亡胚的尿囊液,其HA为7log2;加入0.1%浓度的甲醛溶液在37℃条件下作用24小时可彻底将病毒灭活;将4%的吐温-80均匀加入抗原液制备成水相,将6%的司本-80加入MARCOL-52医用白油充分混合后经121℃灭菌30分钟制备成油相,将水相和油相按照1:3的比例在无菌条件下均匀乳化,制成的疫苗为油包水型白色乳状液,稳定性和粘度均符合国家生物制品质量标准要求;疫苗通过培养基培养无菌,单剂量重复接种和双剂量一次接种均安全,无不良反应;通过颈背部皮下注射的途径接种疫苗产生的抗体水平略高于胸部肌肉注射途径接种产生的抗体水平,且操作方便易于吸收;颈背部皮下注射0.5ml/羽即可产生较好的抗体水平;疫苗免疫后3周用强毒攻毒,其保护率为100%;鸽新城疫油乳剂灭活疫苗扣商品化的鸡新城疫油乳剂灭活疫苗免疫非免鸽,其HI抗体没有明显差异,但免疫后21d用鸽新城疫病毒(JSG株)攻毒,鸽新城疫油乳剂灭活疫苗的保护率为100%(10/10),鸡新城疫油乳剂灭活疫苗保护率为80%(8/10),表明鸽新城疫油乳剂灭活疫苗比鸡新城疫油乳剂灭活疫苗免疫效果好,对强毒的保护率高。
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