麦类作物中阻遏白粉菌抗性相关WRKY转录因子的功能分析

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WRKY转录因子是植物中存在的一类转录因子大家族,它们通过结合靶标基因启动子区的顺式作用元件W-box调控基因的表达,从而参与植物的各种生理活动。大量研究表明,很多WRKY转录因子受到病原菌的诱导,作为正调控或负调控因子在植物的防御反应中起重要作用。已有研究表明HvWRKY1/2负调大麦对白粉病的本底抗性以及大麦抗病蛋白MLA介导的小种专化抗性。  本研究首先从小麦中克隆了HvWRKY1/2的同源基因TaWRKY1/2,并研究了它们在小麦对白粉病抗性中的功能。单细胞瞬时表达实验及大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默技术实验表明,小麦TaWRKY1/2是白粉病本底抗性的负调因子;但瞬时过表达TaWRKY1/2并不影响小麦Pm21介导的广谱抗性;拟南芥原生质体转染实验表明,TaWRKY1具有转录抑制活性而TaWRKY2没有转录激活活性;瞬时过表达实验表明,小麦TaWRKY1/2在对白粉病的抗性反应中以转录抑制因子的形式发挥它们对本底抗性的负调控功能。  通过酵母双杂交方法筛选到HvWRKY1/2的互作蛋白HvWRKY3,它们之间的相互作用得到双分子荧光互补实验的验证。瞬时过表达实验表明HvWRKY3不仅抑制了大麦对白粉病的本底抗性,而且阻遏了MLA介导的小种专化抗性,在大麦对白粉病抗性中起负调控作用;但与HvWRKY1/2不同的是,HvWRKY3不能和MLA相互作用。  进一步通过酵母双杂交方法筛选到HvWRKY3的互作蛋白蔗糖非发酵相关蛋白激酶HvSnRK1,它们之间的相互作用得到双分子荧光互补实验的验证。功能分析结果显示,大麦中瞬时过表达HvSnRK1能显著增强大麦对白粉病的本底抗性;农杆菌介导的瞬时表达实验表明,在本生烟草中过表达HvSnRK1能引起细胞死亡。HvSnRK1的抗病功能依赖于其细胞核中的定位而不依赖于在细胞质中的定位,而HvSnRK1在细胞核和细胞质中定位均能引发细胞死亡。HvSnRK1所引发的细胞死亡需要激酶结构域的存在,而HvSnRK1所具备的抗病功能依赖于它的激酶活性,HvSnRK1含有的自抑制基序(AIS)可能决定了HvSnRK1蛋白的积累。进一步的实验证实,在本生烟系统中激活HvSnRK1引发的级联反应,能促进HvWRKY3的降解,有趣的是它的降解并不依赖于26S蛋白酶体降解途径。初步的研究结果表明,HvSnRK1和大麦抗病蛋白MLA能相互作用;在本生烟草中共表达HvSnRK1和MLA显著增强了MLA引发的细胞死亡反应;BSMV-VIGS沉默HvSnRK1导致MLA12介导的小种专化抗性部分丧失。  以上结果表明,HvSnRK1可能是大麦对白粉病本底抗性和MLA介导的小种专化抗性的正调因子。
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