论文部分内容阅读
背景与目的胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,死亡率极高,严重威胁人类的健康。其中,亚洲的胃癌发病率是最高的,中国的胃癌病例数占全亚洲的42%。胃癌患者的预后与发现时候的肿瘤分期密切相关,越晚期预后就越差。因此,在分子生物学飞速发展的时代,从基因水平上检测胃癌的高危易感人群、探究其发病和发展机制在胃癌的诊断和治疗方面非常重要。microRNAs(miRNAs)是一类长约19~22个核苷酸(nt)的单链非编码RNA。它们参与调节人类多种基因的转录表达,与很多肿瘤的发生发展相关,因此具有癌基因或抑癌基因的功能。为探究miRNAs与胃癌的关系,本研究对胃癌组织和癌旁组织进行了miRNAs芯片分析,发现胃癌组织中miR-194的表达水平显著低于其癌旁组织。本研究的目标是研究miR-194在胃癌及癌旁组织中的表达水平,研究其与胃癌患者的临床病理特征之间的相关性;研究发现上调miR-194表达对胃癌细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵袭的调控作用,初步发现了miR-194的靶基因及其调控机制。方法1.2006年至2008年之间在郑州大学附属肿瘤医院和郑州大学第一附属医院收集了76例胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织,于液氮中保存。qRT-PCR方法检测了胃癌组织和癌旁组织中的RBX1基因和miR-194的表达水平,分析其表达水平与胃癌患者临床病理学特征之间的相关性。2.根据miR-194和RBX1基因的表达水平,将胃癌患者分为高表达组(≥平均值)和低表达组(<平均值),用统计学软件SPSS 17.0分析了它们的表达水平与患者生存期之间的相关性。3.合成miR-194 agomir和miR-194 negative control,利用脂质体将其转染入BGC-823和NCI-N87胃癌细胞。胃癌细胞分成三组:miR-194组,转染miR-194agomir;NC组,转染miR-194 negative control;Blank组,仅加入脂质体。4.CCK-8实验检测发现上调miR-194对胃癌细胞增殖的影响。5.流式细胞术发现上调miR-194的表达对胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响。6.Transwell实验发现miR-194的上调对胃癌细胞侵袭的影响。7.划痕实验发现miR-194的上调对胃癌细胞迁移的影响。8.miRanda和TargetScan软件预测了miR-194的靶基因。构建RBX1 3’UTR区的野生型与突变型的重组双报告基因载体,然后分别利用miR-194 agomir和miR-194 negative control共转染入BGC-823或NCI-N87胃癌细胞中,检测荧光素酶的活性。9.构建无3’UTR区的RBX1的表达载体,与miR-194 agomir共转染入BGC-823细胞中,利用restore实验来验证miR-194对RBX1的调控机制。结果1.在胃癌组织中,miR-194的表达水平明显低于其癌旁组织(P<0.01),而RBX1基因的mRNA水平明显高于其癌旁组织(P<0.01),并且miR-194的表达水平与RBX1的mRNA水平呈负相关。胃癌组织中miR-194和RBX1基因的表达与胃癌患者的肿瘤大小、转移、TNM分期及淋巴结转移均存在相关性(P<0.05),且RBX1的表达水平还与肿瘤的位置相关(P<0.05)。2.miR-194高表达组的胃癌患者有较长的生存期(P<0.05),RBX1基因的mRNA高表达组的胃癌患者具有较短的生存期(P<0.05)。3.CCK-8实验结果显示,miR-194组的胃癌细胞在24 h、48 h和72 h时在450nm处吸光度显著低于对照组(P<0.05)。4.流式细胞术检测细胞凋亡实验结果显示,miR-194组胃癌细胞的凋亡百分比显著增加(P<0.01)。5.流式细胞术检测细胞周期实验结果显示,miR-194组胃癌细胞在G0/G1期的细胞百分比显著增加(P<0.01)。6.Transwell实验结果表明,miR-194组穿过基底膜的胃癌细胞数量明显降低(P<0.01)。7.划痕实验结果表明,miR-194组胃癌细胞的密度明显降低。8.Western blot与双荧光素酶报告结果表明,miR-194直接靶向作用于RBX1基因。9.Restore结果表明,miR-194结合在RBX1的3’UTR区,负调节其表达,抑制胃癌细胞的侵袭。结论1.胃癌组织中miR-194的表达水平明显低于其癌旁组织,其表达水平与胃癌患者的肿瘤大小、肿瘤是否发生转移、TNM分期以及淋巴结转移情况有关,且miR-194高表达组的胃癌患者具有较长的生存期。2.miR-194通过作用于RBX1的3’UTR区,负向调控RBX1的表达,从而抑制胃癌细胞的生长和转移,促进细胞凋亡和细胞周期的阻滞。