为研究草鱼抗病基因的基因组结构，发掘草鱼自身抗病基因和免疫相关基因，同时为了推进比较基因组的研究。在本实验室曾经报道了26条草鱼MHC Ⅰ(Ctid-MHC Ⅰ)cDNA序列，分析了多态性，并对Ctid-MHC Ⅰ基因组进行了初步分析的工作基础上，希望通过对Ctid-MHC Ⅰ基因组结构的分析，阐明Ctid-MHC Ⅰ在基因组中的分布、数目及相互的关系，从而可以为Ctid-MHC Ⅰ的功能研究提供依据。 首先用已知cDNA序列的草鱼(fish C)的MHC Ⅰ的α3区做探针，对EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，HindⅢ，三种酶切的基因组进行了Southern杂交。在获得草鱼MHC Ⅰ基因组信息的基础上，借助fosmid文库研究功能基因的独特优势，我们将草鱼(fish C)DNA，机械裂解后，经末端补平，琼脂糖凝胶电泳回收25-45kb的DNA片段，与同样平末端的PcclFOS载体连接，经λ噬菌体包装转染EP1300大肠杆菌后，铺板，挑单菌落保存于96孔板，最终构建了草鱼fosmid文库，命名为GCFL。为验证GCFL的库容与质量，用脉冲场电泳分析了50个经Not Ⅰ酶切随机挑选的克隆，并用3D-PCR技术对GCFL进行了11个功能基因(MHC Ⅰ，MHC Ⅱα，MHC Ⅱβ，IFN-α，Mx，CD8α，IgMCH4，β2m，C3b，GH，β肌动蛋白)的筛选。 然后挑选两个含MHC Ⅰ的fosmid克隆命名为GCFL-0405E6、GCFL-07311G8，分别摇菌提取质粒DNA后，超声波裂解，经末端补平，琼脂糖凝胶电泳回收2．3kb的DNA片段，与同样平末端的pGEM-T载体连接，转入JM109大肠杆菌中，然后铺板，建立亚克隆库。随机挑菌经鉴定后测序。进行序列拼接，最后获得了两个长度分别为33kb和36.3kb的草鱼基因组序列，并对其进行了基因预测、启动子分析和同源性比较等一系列研究。 结果显示：通过Southern杂交，MHC Ⅰα3区与三种酶切的基因组有4条带，推断草鱼的2倍体基因组可能有2个基因座，4个等位基因；同时我们成功构建了草鱼fosmid基因组文库，构建的GCFL包含129,014克隆，单克隆保存于96孔板中，文库含有1344块96孔储菌板，每12块96孔板组成一个超级池，文库一共由112个超级池构成。通过脉冲场电泳分析经Not Ⅰ酶切的fosmid克隆，显示平均插入片段为35kb，通过计算GCFL覆盖了4.1倍草鱼基因组。用3D-PCR法筛选的11个功能基因，阳性克隆个数为1-6，通过在斑马鱼的染色体定位显示这些基因可能遍布于草鱼不同染色体上，证明从GCFL中可以筛到任何有用的功能基因。 在克隆GCFL-07311G8和GCFL-0405E6中，包含的完整的MHC Ⅰ基因，分别命名为：Citd-UAA和Citd-UBA。通过基因预测、启动子分析和同源性比较等分析认为：Citd-UAA和Citd-UBA是经典的MHC Ⅰ基因，都具有表达功能，两者属于草鱼MHC Ⅰ基因的不同等位基因座，与Southern杂交结果，草鱼可能有2个MHC Ⅰ等位基因座相符。 综上所述：在经过Southern杂交，推断草鱼的2倍体基因组可能有2个基因座的基础上，通过筛选GCFL，我们获得了Citd-UAA和Citd-UBA两个MHC Ⅰ等位基因座的基因组序列，为进一步分析Ctid-MHC Ⅰ的功能提供了依据。