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松科(Pinaceae)冷杉属(Abies)植物在我国资源丰富、分布广泛,其中的一些植物有民间药用的记载。前期研究表明,冷杉属植物的化学成分具有多样性,主要富含萜类成分,这些萜类成分具有结构类型多、取代位置多、手性中心多、重排异构多的特点；冷杉属植物也具有广泛的生物活性,尤其是具有潜在的抗肿瘤和抗炎活性。岷江冷杉(Abies faxoniana)是我国特有冷杉属植物,主要分布于四川省和甘肃省,此前尚未有该植物的化学成分和生物活性研究的相关报道。本课题以岷江冷杉为对象研究了它的化学成分与体外抗肿瘤活性。1.化学成分研究采用多种分离纯化技术和波谱分析方法从岷江冷杉乙醇粗提物的二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位中分离鉴定了101个化合物,其中新化合物41个。这些化合物包括60个三萜类、23个二萜类、8个木脂素类、2个苯丙素类、2个单萜类、1个黄酮类以及5个其它类化合物。在本课题研究中,从岷江冷杉分离鉴定的三萜类化合物主要以羊毛脂烷型为主,包含9对具有螺内酯结构的三萜化合物(wgw-1/1’-wgw-9/9’),这个特征性的螺内酯结构片段的立体构型通过X-ray单晶衍射和核磁方法确定。其中化合物wgw-8/8’由于7(8→9)重排形成一个螺B/C环(spiro B/C ring)结构。这9对三萜化合物通常都是以互变的混合物形式存在,原因是在23位上的碳螺原子(C-23 spiro carbon)发生差向异构化。我们用HPLC方法证实了差向异构体wgw-1/1’之间,wgw-2/2’之间以及wgw-9/9’之间的相互转化。与wgw-1/1比较,wgw-9/9’由于侧链螺内酯结构上C-24/25双键导致它们之间的转化速度较慢。接下来也通过HPLC测定了这些差向异构体之间比例分别为3：1,2：1,3：1,2：1,4.5：1,4.5：1,8：1,10：1,3：2。考虑到溶剂对差向异构化的影响,我们通过半制备HPLC同时获得两份wgw-2,并在同样的时间得到了它们在CDCl3和CD3OD的13C NMR谱。通过比较发现这两个13C NMR谱基本相似,说明这两种溶剂对这类化合物的差向异构化影响较小。化合物wgw-19-wgw-21由于半缩酮γ内酯结构(γ-lactone moiety with a hemiketal)上的23位碳原子差向异构化也是以不可分离的混合物形式存在,这种类似结构的互变混合物已经有相关文献报道。化合物wgw-26-wgw-30的结构特征在于A环开环,此外,化合物wgw-27还由于8(14→13)重排形成一个螺C/D环(spiro C/D ring)结构。在化合物结构鉴定方面,除了运用高分辨质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振谱(NMR)以及X-ray单晶衍射外,还采用圆二色谱(CD)和PGME法确定化合物的绝对构型。以化合物wgw-11和wgw-45为例,wgw-11的圆二色谱(CD)中216 nm处有一个负Cotton效应,表明wgw-11侧链内酯环结构上的C-23为R构型,而wgw-45中与羧基相邻的C-25绝对构型可以通过PGME法确定,根据△δ=δS-δR可以推断wgw-45中C-25的绝对构型为R。2.体外抗肿瘤活性研究采用MTT法测试了岷江冷杉中分离鉴定的三萜类化合物的肿瘤细胞毒活性(Huh-7,HepG-2,SMMC-7721,HCT-116,MCF-7,A549),其中化合物wgw-18抑制HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞生长的IC50值为9.8μM和14.3μM,wgw-6/6’制Huh-7肝癌细胞生长的IC50值为7.5μM。此外,我们也测试了部分三萜类化合物的DNA拓扑异构酶抑制活性,其中wgw-23对拓扑异构酶Ⅱ抑制活性的IC50值为53.5μM,而拓扑异构酶Ⅱ抑制剂依托泊苷的IC50值为49.6μM。接下来以HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞为模型,通过以下实验研究了wgw-18抑制这两株肝癌细胞生长的作用机制。1.MTT法检测了wgw-18在不同浓度、不同时间情况下对HepG-2和SMMC-7721细胞生长的影响,并初步确定其有效的抑制浓度。结果表明wgw-18能够浓度-时间依赖性的抑制人肝癌细胞的生长。2.MTT法测试了wgw-18对正常肝细胞QSG-7701生长的影响。Hoechst33258染色法检测了wgw-18对QSG-7701细胞的细胞核形态的影响。结果表明不同浓度的wgw-18孵育24小时后,wgw-18对QSG-7701细胞生长没有显著的抑制作用。3.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法和Hoechst 33258染色法检测了wgw-18诱导HepG-2和SMMC-7721细胞凋亡的作用。进一步采用流式细胞仪DCFH-DA染色法,Rhodamine 123染色法和western blot法检测了wgw-18对HepG-2和SMMC-7721细胞内活性氧ROS含量,线粒体膜电位MMP和调亡相关蛋白表达水平的影响。结果表明wgw-18作用HepG-2和SMMC-7721细胞24小时后,线粒体膜电位MMP下降,细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调,促凋亡蛋白Bax的表达上调,cleaved caspase 3, cleaved caspase 9和cleaved PARP蛋白的表达上调,最终导致细胞凋亡。此外,wgw-18能够使HepG-2细胞内ROS含量增加,并且使Akt蛋白的表达下调,但是对SMMC-7721细胞内ROS含量没有影响。4.流式细胞仪和western blot法检测了wgw-18对HepG-2和SMMC-7721细胞生长周期和细胞周期相关蛋白表达水平的影响。结果表明wgw-18通过上调p53和p21蛋白的表达和下调cyclin D1和CDK2蛋白的表达使HepG-2和SMMC-7721细胞生长周期阻滞在G1期。以上实验表明,wgw-18通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制HepG-2和SMMC-7721细胞的生长,其诱导HepG-2细胞凋亡是通过线粒体途径和ROS/Akt通路,而ROS/Akt通路没有参与到wgw-18诱导SMMC-7721细胞凋亡中。