母鸡的卵泡发育受多种激素的调控,是鸡产蛋性状的分子生物学基础。在产蛋高峰期的母鸡卵巢中,8-13个直径为6-8mm的小黄卵泡中有一个经选择进入等级卵泡阶段,快速生长发育直至排卵,即为卵泡选择。卵泡选择是维持正常产蛋的关键过程,目前已有研究证明多种激素、生长因子及其受体参与卵泡选择,调控卵泡的发育。对鸡卵泡选择分子机制的研究,有助于鉴定鸡及其它家禽产蛋性状的关键基因,为提高鸡的产蛋和繁殖性能提供理论依据。为了进一步揭示鸡卵泡选择的分子机制,本研究对等级前卵泡(6-8mm小黄卵泡,S)和刚进入等级发育的卵泡(12-15mm卵泡,一般为F6,F)进行了转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组的测序和生物信息学分析,鉴定出两个发育时期卵泡的差异表达基因、蛋白和蛋白磷酸化位点,进一步分析了影响卵泡选择的基因和蛋白质,以及在鸡卵泡选择过程的作用机制。结果如下:(1)鸡小黄卵泡与F6卵泡的转录组学分析。转录组测序共检测到20,679个表达基因,以|log2(FoldChange)|>1和padj<0.05为筛选差异基因的标准,共筛选到差异表达基因855个,其中上调基因202个,下调基因653个。差异表达的基因主要富集到细胞分化,细胞发育过程等功能上;差异表达的基因主要参与TGF-β信号通路,酪氨酸代谢和细胞因子受体相互作用等信号通路。同时,在鉴定的DEGs中,VLDLR1、WIF1、NGFR、AMH、BMP15、GDF6和MMP13等7个基因的mRNA水平表达变化通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)进行了验证,结果与测序结果基本一致。(2)鸡小黄卵泡与F6卵泡蛋白质组学分析。蛋白质组学分析共定量到5236个表达蛋白,以F/S差异倍数值大于1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准,共筛选到差异表达蛋白259个,其中上调蛋白175个,下调蛋白84个。GO和KEGG通路富集分析表明,这些蛋白主要涉及肽酶/肽链内切酶抑制剂活性等生物功能,参与核糖体、神经活性配体-受体相互作用等信号通路。同时,在鉴定的DEPs中,VLDLR、VTG1、VTG3、PSCA、APOB、APOV1、F10、ZP2和ZP3L2等9个蛋白的表达变化通过靶向平行反应监测技术(PRM)进行了验证,结果与测序结果基本一致。(3)鸡小黄卵泡与F6卵泡转录组和蛋白组学联合分析。卵泡选择前后转录组和蛋白组变化的相关系数为0.23,蛋白质与mRNA表达之间存在较弱的关系。为了进一步了解转录本与蛋白质之间的关系,我们比较了DEGs和DEPs之间的交集,大多数基因的表达在mRNA水平上差异显著,而在蛋白质水平上则差异不显著。在F6中,14个基因在mRNA水平和蛋白水平上均显著上调,26个基因在mRNA水平和蛋白水平上均显著下调,此外,有2个基因的表达在mRNA水平和蛋白质水平的变化上不一致。其中,VLDLR在mRNA水平和蛋白水平均呈现显著下调的趋势。进一步研究表明,VLDLR在F6卵泡中的表达明显低于SY卵泡,卵泡颗粒细胞(GCs)中VLDLR的表达明显高于膜细胞(TCs);FSH在等级前和等级卵泡的GCs中均可以促进VLDLR的表达,在后者上的效应为剂量依赖型。(4)鸡小黄卵泡与F6卵泡磷酸化蛋白质组学分析。磷酸化蛋白质组分析共定量到1851种蛋白3576个差异磷酸化位点,以F/S差异倍数值大于1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准,在F6卵泡中,119种蛋白190个位点磷酸化水平发生了显著的变化。GO和KEGG富集分析表明,这些蛋白主要涉及跨膜转运、脱氢酶活性等生物功能,参与RNA降解、细胞因子受体相互作用等通路。其中,组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(Lysine specific demethylase 1,LSD1)第65位丝氨酸的磷酸化(LSD1Ser65p)在卵泡选择以后显著升高(P<0.05),并经Western blot分析得到了验证。综上所述,本研究利用转录组测序技术、基于TMT标记和LC-MS/MS的蛋白组学以及磷酸化蛋白质组学鉴定技术,建立了鸡卵泡选择前后卵泡基因和蛋白质表达谱,筛选了卵泡选择前后在mRNA、蛋白质和磷酸化修饰水平发生变化的部分基因和蛋白质。生物信息学分析进一步明确了差异表达基因/蛋白间的关系和功能,筛选并初步验证了VLDLR和LSD1Ser65p可能参与鸡的卵泡选择过程。这些结果有助于鉴定参与鸡卵泡发育和选择的功能基因和蛋白质,并为明确鸡卵泡选择的调控机制奠定了基础。