基于肽键热振荡理论对蜈蚣炮制机理研究

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蜈蚣天然资源丰富,人工养殖技术成熟,使得蜈蚣研究经济效益可观,但对其有效成分及机理研究不甚确切,缺乏系统研究。中药炮制学中记载焙蜈蚣,取净蜈蚣,除去头足用文火焙至黑褐色质脆时,放凉。多用于急慢惊风、破伤风等症的痉挛抽搐,癫痫。  目的:  查阅近年来的文献,未见有对蜈蚣炮制前后活性对比研究的相关报导,阻碍了蜈蚣资源的进一步开发与利用。因此本文依据肽键热振荡理论,采用现代分析和药理研究技术,研究蜈蚣炮制前后化学成分组成及结构不同程度改变与活性效应的关系,从而明确蜈蚣的炮制机理。  方法:  本文以羟基自由基清除率、活化部分凝血酶时间(APTT)为活性指标,筛选蜈蚣6个极性部位提取物的活性。利用闪提和超滤技术将蜈蚣生品水溶性组分分为四个部分:>10 KDa部分、3-10 KDa部分、1-3 KDa部分和<1 KDa部分。采用羟基自由基清除率、肝癌HepG2细胞增殖抑制率、APTT时间共同筛选蜈蚣生品活性部位。在蜈蚣炮制机理研究中,以APTT时间分析蜈蚣寡肽<1 KDa部分活性,运用主成分和灰色关联度分析、结合偏最小二乘分析方法分析蜈蚣炮制前后化学成分的变化。以羟基自由基清除率和寡肽含量为指标筛选最佳炮制工艺;以羟基自由基清除率和水解度为指标筛选蜈蚣最佳酶解条件,通过单因素和正交分析筛选最佳酶解条件。以羟基自由基清除率、APTT时间、肝癌HepG2细胞增殖抑制率及寡肽含量为指标,对比炮制前后及天然寡肽与酶解寡肽的变化。  结果:  本文通过对蜈蚣活性部位筛选,确定了生品水溶性组分和生品<1 KDa寡肽部位活性最好。通过分析炮制前后成分改变与活性效应的关系,确定了氨基酸Asp、Thr、Glu、Ala、Tyr、Phe对APTT时间有重要影响;而寡肽液质指纹图谱中的2、5、7、8、10号峰对APTT时间影响较大,其中5号和7号峰结构分别为NH2-Lys-Phe-COOH、NH2-Met-Glu-COOH。通过对蜈蚣炮制工艺参数的优化,确定最佳炮制条件为195℃下,焙制5min。蜈蚣寡肽炮制前羟基自由基清除率IC50值、APTT时间及寡肽含量分别为1.1119 mg/ml、37.3s、17.61%;炮制后分别为1.0125mg/ml、38s、60.99%。通过对酶解工艺筛选,确定了最佳工艺酶为应用胰蛋白酶;酶解5h,温度45℃,酶底比6%,pH值为9。  结论:  通过对比蜈蚣炮制前后抗氧化活性、APTT时间及寡肽含量,得出结论炮制后蜈蚣寡肽活性增加,寡肽含量也增加,这可能是由于高温作用下肽键裂解生成了更多小分子量的寡肽。一般来说,高温使蛋白变性,但本实验发现高温炮制后样品活性反而增强,说明炮制对蜈蚣有积极意义,存在开发研究价值。通过对比天然寡肽与酶解寡肽的活性与收率,发现天然寡肽较酶解寡肽活性好,但酶解寡肽寡肽含量较高,仍可考虑酶解作为天然寡肽的替代品。
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