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背景和目的:甲状腺癌(thyroid carcinoma;TC)约占人类所有恶性肿瘤的1%,而在内分泌恶性肿瘤中所占比例高达90%。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是其中最常见的一类,占所有TC的70-80%,而且近年来PTC的发病率逐渐升高。大多数PTC经过外科切除术,TSH抑制治疗或联合放射性碘治疗能得到良好的治疗效果。但仍有少部分PTC恶性程度极高,带来比较严重的后果。一项研究表明,PTC的遗传改变是由癌基因的激活和抑癌基因的失活引起的。虽然在甲状腺癌中发现了许多遗传变异,但PTC的分子机制尚不清楚。因此,进一步研究PTC发生和发展的机理是十分必要的。中心体63号蛋白(Centrosomal protein 63,Cep63)是中心体的前体,位于染色体3q22.2上,编码一个63kDa蛋白,有6个螺旋结构域;它以其结合Cep152形成中心体环状结构基底的能力而闻名。既往研究发现,Cep63在纺锤体失活后,参与纺锤体组装和DNA损伤,与中心体结合,调节有丝分裂,并引起染色体不稳定和畸变,导致预后不良,可能存在癌相关过表达。Cep63已被证明可以促进肿瘤的发展和进化;然而,Cep63与PTC发展之间的关系尚不明确。本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除Cep63,阐明其对TPC-1细胞行为的影响。进一步研究了 Cep63对TPC-1细胞中信号通路的影响。材料与方法:1.通过Western blotting检测人甲状腺癌细胞系TPC-1、FTC-133和正常甲状腺细胞系Nthy-ori-3中Cep63在翻译水平的表达情况。采用qRT-PCR检测140对甲状腺乳头状癌组织及相对应的正常甲状腺组织中Cep63的转录表达水平,并对Cep63的表达水平与年龄、性别、淋巴结转移、病理分期的情况进行相关性分析。2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TPC-1细胞中的CEP63基因,构建Cep63-KO稳定传代细胞系,通过Western blotting和qRT-PCR检验Cep63的敲除效率。通过CCK-8和平板集落形成实验检测Cep63基因敲除对TPC-1细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术检测Cep63对TPC-1细胞周期和凋亡能力的影响;通过细胞划痕实验、transwell实验检测Cep63对细胞侵袭和迁移能力的影响。3.检测Cep63与JAK/STAT3和AKT/ERK信号通路的关系,通过Western blotting检测TPC-1和Cep63-KO细胞中相关通路蛋白的表达水平,通过JAK抑制剂LY2784544处理,进一步检测通路在细胞中的作用。4.通过裸鼠皮下成瘤试验检测TPC-1和Cep63-KO细胞在体内增殖能力的差异,并记录瘤体体积以及鼠重的变化,最后处死老鼠后剥离瘤体并称量瘤重,评估两组细胞在体内成瘤效果的差异。将细胞及小鼠瘤体进行免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC),检测相关蛋白的表达情况。结果:1.Cep63在PTC组织中的表达明显高于正常甲状腺组织;与正常甲状腺Nthy-ori-3细胞相比,Cep63在TPC-1细胞中明显上调。通过分析Cep63表达水平和临床病理特征之间的关系,发现Cep63高表达与淋巴结转移有显著的相关性,而患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、BRAF突变状态与Cep63表达水平无相关性。2.通过CRISPR/Cas9技术敲除Cep63基因,抑制其在细胞的表达,RT-PCR和Western blotting结果显示Cep63在细胞中表达缺失。CCK-8与平板克隆实验结果显示,Cep63-KO细胞的增殖能力和克隆形成能力明显降低;流式细胞术结果显示,与TPC-1细胞相比,Cep63-KO细胞G0/G1期比例明显减少,S期比例明显增多,细胞从G0/G1期向S期过渡明显增加,Cep63-KO细胞的凋亡率明显高于TPC-1细胞(20.1%、2.0%)。细胞迁移和侵袭实验结果显示,与TPC-1细胞相比,Cep63基因敲除后细胞迁移率降低了 25.31%,Cep63-KO细胞穿透transwell 膜的数量明显低于 TPC-1 细胞(147.0±10.12 和 226.3±11.89)。3.与TPC-1组相比,Cep63-KO组的p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平分别降低了 19.3%和39.4%。JAK抑制剂LY2784544处理后,TPC-1细胞中p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平分别降低20.0%和15.6%。与TPC-1组相比,Cep63-KO组AKT、ERK和CDK1蛋白表达水平明显降低(分别为77.8%、22.3%和66.9%)。凋亡蛋白BAX表达明显上调,Bcl-2表达受到显著抑制。4.动物试验结果显示,Cep63-KO组肿瘤生长速度较TPC-1组明显缓慢,Cep63-KO组肿瘤体积和重量明显低于TPC-1组。此外,随着肿瘤的生长,TPC-1组小鼠的体重显著下降,而Cep63-KO组小鼠的体重逐渐增加。IHC结果显示,Cep63-KO组相关蛋白AKT、ERK表达均降低。Cep63-KO细胞中抑制凋亡蛋白Bcl-2表达降低,而促凋亡蛋白BAX表达升高。结论:Cep63在PTC组织和TPC-1细胞中高表达,与淋巴结转移明显相关,可能参与了 PTC的发生进展。Cep63敲除可能通过抑制JAK/STAT3通路的活化,继而抑制TPC-1细胞的增殖、侵袭及迁移等,此外Cep63的表达也可能与AKT/ERK通路密切相关。Cep63参与调控了 TPC-1细胞在体内的成瘤能力,基因敲除后TPC-1在体内增殖能力明显降低。Cep63敲除在抑制TPC-1细胞恶性生物学行为中有明显作用,Cep63可能是PTC新型治疗的一个潜在靶点。