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循环肿瘤DNA(ctDNA)是凋亡或坏死的肿瘤细胞释放到血液中的小片段DNA。由于ctDNA收集方便、无创,并且能够及时反映肿瘤状态,所以ctDNA可辅助甚至替代组织标本作为临床的诊断、监测以及分子靶向治疗指标。但是,当前报道的ctDNA检测方法因其在灵敏度、稳定性或多指标检测等方面的不足会限制ctDNA的临床应用。近年来,纳米技术对生物与医学领域产生了深远影响。纳米材料因其独特的光、电、磁、热等性能被用来提高传统医学诊断技术以及开发新的检测方法,然而它在ctDNA领域的应用还处于起步阶段。在本论文中,我们基于肽核酸(PNA)联合不对称PCR(aPCR)扩增和以双色荧光编码磁球为核心的液相芯片分离检测平台构建了一种灵敏度高、特异性好,并且能够对突变型ctDNA进行多指标检测的方法,即PNA-aPCR-Liquidchip,并且通过检测作为非小细胞肺癌(NSCLC)的重要驱动基因突变与分子治疗靶点的EGFR突变来探究该方法的可行性。本论文的主要研究内容包括以下三方面:i)分别建立适合EGFR E19Del、L858R以及T790M突变的PNAaPCR-Liquidchip检测方法。研究结果表明,PNA-aPCR-Liquidchip适用于稳定的缺失型和点突变型基因的检测,它的特异性受PNA-aPCR扩增中的引物和PNA影响,而且它能够从10000 copies野生型EGFR中筛查出5 copies突变基因,使得突变基因的检出率达到0.05%。ii)基于单指标检测的基础上进一步研究PNA-aPCR-Liquidchip对EGFR突变的多指标检测。研究结果表明,多指标检测的PNAaPCR-Liquidchip受多重PNA-aPCR扩增中的循环次数、引物退火温度,以及Liquidchip过程中的杂交液、杂交温度、杂交时间等因素的影响。另外,多指标检测的PNA-aPCR-Liquidchip也具有很高的灵敏度,能够在10000 copies野生型EGFR的背景下同时检测出2 copies L858R、5 copies E19Del以及5 copies T790M突变基因,从而使多指标的PNA-aPCR-Liquidchip能够获得0.02%~0.05%的灵敏度。iii)利用建立的PNA-aPCR-Liquidchip多指标检测方法筛查56例NSCLC患者血浆游离DNA(cfDNA)中的EGFR突变,并且通过ddPCR、Scorpion ARMS的诊断结果评估该方法的准确性。研究结果表明,PNA-aPCR-Liquidchip的判定结果与ddPCR、Scorpion ARMS没有统计学差异。其中,PNA-aPCR-Liquidchip在筛查E19Del、L858R以及T790M时,与ddPCR分别具有95%(53/56)、95%(53/56)以及88%(49/56)的符合度,而且在筛查E19Del时具有96%(49/51)的特异度和80%(4/5)的敏感度,筛查L858R时具有95%(40/42)的特异度和93%(13/14)的敏感度,筛查T790M时具有93%(40/43)的特异度和69%(9/13)的敏感度。另外,我们发现PNA-aPCRLiquidchip的敏感度甚至高于Scorpion ARMS。由此说明,利用PNAaPCR-Liquidchip筛查NSCLC患者血浆cfDNA中的EGFR突变是可行的并且具有很好的应用前景。