研究背景卵巢癌严重威胁妇女生命健康,死亡率居妇科恶性肿瘤首位,五年生存率徘徊在30%左右。由于其发病隐匿,早期缺乏有效的诊断筛查方法,而且极易出现侵袭转移。因此,确诊时多为晚期,严重影响卵巢癌患者的预后。其中,侵袭转移成为卵巢癌治愈困难的瓶颈之所在。目前,基因治疗已成为卵巢癌治疗领域的研究热点,并且在动物实验及Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期临床研究中取得了一定疗效,有望成为继手术、放化疗后的一种全新的治疗模式。有文献报道,BRMS1基因作为一种肿瘤转移抑制基因,能抑制包括卵巢癌在内的多种肿瘤的侵袭、转移。但由于其作用复杂而非典型,且具体作用机制方面的研究尚少,因此,通过细胞水平的体外实验研究BRMS1基因对卵巢癌侵袭转移的作用及其机制,可为探索控制卵巢癌侵袭和转移靶向性基因治疗的新靶点,奠定临床理论基础,具有一定的科学研究意义和潜在的临床应用价值。研究目的利用RNA干扰技术,建立瞬时转染,通过研究BRMS1基因的沉默前后,观察人卵巢癌细胞株OVCAR3侵袭、转移能力的变化,并检测与肿瘤转移相关蛋白NF-κB p65、OPN及uPA表达的差异,以探讨BRMS1基因对卵巢癌细胞侵袭、转移的作用及可能机制。研究方法1)利用细胞培养技术对人卵巢癌OVCAR3细胞株进行培养将卵巢癌细胞株OVCAR3置于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的高糖型DMEM培养液中,37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,贴壁生长至细胞融合度80%-90%时进行转染实验。2)利用RNA干扰技术,构建BRMS1基因沉默的人卵巢癌OVCAR3细胞株根据GenBank中BRMS1基因序列设计三条靶序列siRNA以及一条阴性对照序列NC-siRNA,并交由生物技术公司合成。取生长状态好的卵巢癌细胞随机分成3组:转染组、阴性对照组及空白对照组,按照脂质体说明书进行转染。转染后48小时提取细胞总RNA和总蛋白,分别进行实时荧光定量PCR及western blot实验,从mRNA与蛋白水平筛选并鉴定沉默效率最高的一对siRNA,进行后续实验。3) Transwell侵袭及迁移实验检测卵巢癌细胞侵袭转移能力的变化Transwell侵袭实验是将小室底部膜的上室面包被好Matrigel基质胶,上室加入上述3组转染后24h的适宜数目(每孔5×10~4个)卵巢癌细胞,培养液不含血清,下室加入10%血清的完全培养液,培养24h,小心用棉签拭净基质胶及上室面细胞,结晶紫染色后,计数穿过基质胶的下室面附着细胞数。Transwell迁移实验方法基本同于前者,不同的只是小室上室面不包被基质胶。4) Western blot法、免疫细胞化学法或细胞免疫荧光法检测蛋白NF-κB p65、OPN及uPA表达的变化分别采用Western blot法、免疫细胞化学法或细胞免疫荧光法对三种蛋白NF-κB p65、OPN及uPA进行定量和定性分析,检测这些转移相关蛋白的表达,在BRMS1基因沉默前后如何变化。5)统计学分析计量资料以均数±标准差((χ|-)±s)表示,采用SPSS l6.0统计软件,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.筛选出了基因沉默效率较高的BRMS1-siRNA,基因沉默效率高达82.3%,为构建逆转录病毒载体,进一步实现稳定转染奠定基础。2. BRMS1-siRNA转染人卵巢癌细胞OVCAR3,有效沉默BRMS1基因后,细胞的侵袭、转移能力较两对照组明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。3. BRMS1-siRNA转染人卵巢癌细胞OVCAR3,有效沉默BRMS1基因后,通过Western blot法、免疫细胞化学法或细胞免疫荧光法对肿瘤转移密切相关蛋白NF-κB p65、OPN及uPA的表达进行定性和定量分析,结果发现实验组较两对照组均明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BRMS1基因可抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移,机制可能与NF-κB信号转导通路有关,通过抑制NF-κB的活性,下调uPA、OPN的表达,从而实现抑制卵巢癌的远处转移。