骨缺损是当前社会面临的严重的健康问题。对于骨缺损传统的治疗方法是通过自体骨或异体骨移植、人工骨移植及各种骨诱导剂与人工骨的结合应用,但这些方法都存在相应的缺陷。目前研究较多的是采用组骨组织工程的方法研究具有与自然骨相似的人工骨替代材料来修复骨缺损部位。常用的骨组织工程材料有天然高分子材料和天然无机材料,以及两种或多种材料的复合材料。骨的主要成分是胶原(CoL)和羟基磷灰石(HA)。HA根据颗粒尺寸分为纳米级的羟基磷灰石粉末和微米级的生物陶瓷。合成纳米羟基磷灰石(nHA)晶体在尺寸和晶体结构方面与天然骨中的羟基磷灰石相似;煅烧骨(TBC)是动物骨经过高温煅烧去除胶原后得到的一种以羟基磷灰石为主要成分的无机材料,其晶体结构和孔结构与自然骨的高度相识,被认为是制备骨替代材料最适无机材料。目的:本实验拟将nHA、TBC和CoL复合,制备nHA/CoL、TBC/CoL两种复合支架,并对支架进行理化性能表征;从细胞生物学角度评价nHA/CoL、TBC/CoL复合支架对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)生长代谢及成骨相关基因表达的影响,比较nHA和TBC的促成骨相关细胞成骨分化能力,为临床制备骨替代材料的选材提供理论依据。方法:实验用酸溶法溶解胶原,并用冷冻干燥法制备胶原支架;通过对支架进行扫面电镜(SEM)观察,检测支架孔隙率、孔径及拉伸模量等指标,通过正交实验优选制备胶原支架最适的胶原浓度及制备条件;随后,用最适胶原浓度分别与nHA和TBC混合,制备nHA/CoL和TBC/CoL复合支架,并对制备得到的支架材料进行理化性能表征;表征指标主要包括对无机材料及复合支架材料的表面形貌,元素组成及分布,支架材料化学结构及无机盐晶体在胶原中晶体取向等进行分析,同时对支架材料进行了戊二醛残留量及亲水性检测。为了评价制备的支架材料生物学性能,实验对在材料上生长的细胞的增殖,凋亡及周期情况进行了检测;同时通过SEM观察了细胞在支架材料上的生长形态,以此评价材料的细胞相容性。最后实验通过Real-Time PCR技术对培养在支架材料的MC3T3-E1细胞内成骨相关基因表达情况进行了检测,以评价材料促细胞成骨分化能力。结果:通过正交设计优选得到制备胶原支架的最适浓度为3%,最适交联条件为交联剂用量为0.2%,交联温度为25℃,条件下交联120min。通过压汞法测得复合支架材料的孔径在100～300μm范围内,孔隙率在70%以上,符合骨组织对支架材料孔隙率与孔径的要求。实验测得nHA/CoL支架材料的弹性模量为7.87±0.23MPa大于TBC/CoL支架及CoL支架(p<0.01);FIRT及XRD结果表明复合支架中CoL发生了矿化,TBC中除了有HA相还有β-磷酸三钙(β-TCP)晶相;HPLC结果表明材料浸提液中戊二醛残留量低于检测限,低于药典规定的最低含量要求;接触角检测结果表明复合支架材料的接触角大于CoL支架组,其中TBC/CoL组接触角最大,疏水性最强。材料细胞毒性实验表明材料毒性为1级,符合国标中对医疗器械毒性反应要求;细胞增殖检测结果显示,第1天和第3天时CoL支架上的细胞增值速率大于复合支架上的细胞增殖速率,第5天和第7天时三组支架上细胞增殖速率基本一致;第9天时,复合支架材料上的细胞增殖速率大于CoL支架上的增殖速率;细胞凋亡检测结果显示TBC/CoL支架材料的凋亡率在第1天时最高,第3天时复合支架材料上细胞凋亡率一致,但都高于CoL组细胞凋亡率。细胞周期检测结果进一步验证了增殖结果;细胞在支架材料上生长形态的SEM结果表明CoL材料更利于细胞早期的黏附,但在第14和第21天时,从代谢产物分泌情况来看复合支架上的细胞生长更旺盛;同时SEM结果还发现细胞对与其接触的材料有降解作用;Real-Time PCR检测结果表明,在成骨诱导剂作用下复合支架对MC3T3-E1细胞内成骨相关基因的表达有显著的促进作用。结论:nHA和TBC表面结构及成分上的差异导致了胶原基复合支架力学性能及粗糙度的差异,进而引起细胞在支架材料上的黏附与增殖以及细胞内成骨相关基因表达等生物学行为的差异。实验结果表明在成骨诱导因子刺激下nHA、TBC能够促进MC3T3-E1细胞内成骨相关基因的表达,且nHA对细胞晚期的成骨和矿化促进作用强于TBC的促进作用,但两种复合支架在体内促成骨能力的强弱以及促成骨机制还有待于进一步研究。