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慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染已经成为一个全球性的公共卫生问题，严重威胁人类健康。无症状携带(Asymptomatic carrier)、慢性乙型肝炎(Chronichepatitis B, CHB)、重型乙型肝炎、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)以及肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)为其不同的临床疾病表型。研究表明，免疫应答是慢性HBV感染致病机制的核心问题，免疫清除后患者痊愈，而持续的免疫损伤则可导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等不同疾病表型。其中，HBV特异性CD4+T细胞是免疫损伤的关键环节，其不同细胞亚群的平衡偏向决定了乙型肝炎患者是否发生免疫损伤，导致了不同的临床转归。人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)复合体是与疾病相关联的一个重要遗传因素。目前许多全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)，在基于大样本患者人群的基础上，发现了HLA-Ⅱ分子基因位点的遗传变异对HBV的感染、清除、肝癌发生发展、疫苗应答等临床转归起着重要作用，从遗传流行病学等角度证实了HLA-Ⅱ分子在HBV保护性免疫中的重要作用[2-4]。HLA-Ⅱ分子正常表达于抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell, APC)，能够提呈抗原进而激活CD4+T细胞(Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh等)应答，启动机体适应性免疫(adaptive immunity)[1]，在T细胞的识别和表位肽识别过程中具有重要作用，一定程度上影响了CD4+T细胞应答的亚群偏向。作为遗传上共显性的HLA-DR、DQ、DP分子，在乙型肝炎遗传易感性中表现出不同的效应，其关联的具体机制尚不清楚。我们对慢性HBV感染患者DC表面的HLA-DR/DQ/DP分子表达表达的组合模式进行观察，并初步观察了HLA-DR/DQ/DP抗原提呈对病毒特异性CD4+T细胞的应答及极化类型独立效应。我们首先分离了10例慢性乙型肝炎轻中度(mild and moderate chronic hepatitis B,MCHB)患者和5例健康对照(Healthy control, HC)的外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells, PBMC)，在利用GM-CSF和IL-4体外诱导DC并刺激成熟后，采用多色流式细胞技术，观察成熟髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell, mDC)表面HLA-Ⅱ分子表达的组合模式。接着我们同时对mDC和浆样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cell, pDC)进行直接观察，通过分离来自26例慢性乙型肝炎轻中度(mild andmoderate chronic hepatitis B, MCHB)、21例慢性乙型肝炎重度(severe chronic hepatitis B,SCHB)以及18例重型乙型肝炎(Acute on chronic liver failure, ACLF)患者、21例慢性乙型肝炎无症状携带者(Asymptomatic HBV carriers, AsC)及17例健康对照(Healthycontrol, HC)的PBMC，采用7色流式细胞技术同时检测CHB患者外周血mDC及pDC占PBMC的比例，以及两种DC亚群细胞表面HLA-Ⅱ分子的表达的组合模式。同时，对4例SCHB和1例MCHB患者mDC和pDC表面HLA-DR/DQ/DP表达模式分别进行了三个不同时相点的连续观察。为了评估HLA-DR、DQ、DP抗原提呈对HBV特异性CD4+T细胞极化的独立效应，我们分离了20例慢性乙型肝炎轻中度患者的PBMC，分别阻断HLA-DR/DQ/DP后，采用HBcAg刺激-T细胞体外扩增和HBcAg表位肽刺激-ex vivo直接检测两种方案，采用胞内细胞因子染色流式细胞术观察CD4+T细胞极化效应。并结合患者临床指标进行综合分析，试图得到对慢性HBV感染患者HLA-Ⅱ分子的表达组合模式及其对T细胞极化效应的影响和临床表型之间关联的初步认识。我们的主要研究结果如下：1．慢性乙型肝炎患者外周血mDC及pDC的比例存在不同程度的下降，且与病情严重程度相关。对慢性乙型肝炎重度患者三个不同时相点的连续观察结果提示，随着患者病情严重程度的减轻，其外周血mDC和pDC的数量和比例有升高。2．健康对照和慢性乙型肝炎患者体内直接观察的mDC表面的HLA-II类分子的主要表达模式为四种，即DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和DR-DQ-DP-组合模式。mDC表面表达DR+DQ+DP+的细胞比例在HC(0.9-39.2)、AsC(0-20.1)、MCHB (1.3-80.7)、SCHB(0.1-90.6)和ACLF(5.2-98.0)组的中位数分别为17.2、5.9、23.3、40.5和37.3，随疾病严重性的增加而显著升高(p＜0.001)。与pDC相比而言，CHB患者和健康对照mDC表面表达DR+DQ+DP+细胞比例高，而DR-DQ-DP-细胞比例低。3．健康对照和慢性乙型肝炎患者pDC表面HLA-II类分子的主要表达模式除了与mDC相同的四种(即DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和DR-DQ-DP-)组合模式之外，在MCHB组、SCHB组和ACLF组还增加了DR-DQ-DP+模式。pDC表面表达DR+DQ+DP+的细胞比例在HC(0.3-21.7)、AsC(0.1-15.2)、MCHB(0.9-57.6)、SCHB(1.2-52.1)和ACLF(0.2-63.6)组的中位数分别为5.2、1.9、7.3、20.3和15.8，随疾病严重性的增加而显著升高(p＜0.001)。pDC表面表达DR+DQ+DP-的细胞比例在HC(4.8-76.5)、AsC(0-42.6)、MCHB(1.3-54.1)、SCHB(0.9-71.4)和ACLF(0.2-38.6)组的中位数分别为32.2、18.7、8.9、11.6和3.2，随疾病严重程度的增加而显著降低(p＜0.05)。同时，pDC表面表达DR-DQ-DP+的细胞比例在HC(0.01-5.8)、AsC(0-0.64)、MCHB(0-54.1,1.94)、SCHB (0-13.4)和ACLF(0-56)组的中位数分别为0.07、0.01、1.9、2.1和3.9，随疾病严重程度的增加而显著增加(p＜0.05)。5个慢性乙型肝炎患者不同时相点的连续观察结果提示类似的变化趋势。pDC表面表达DR+DQ-DP-的细胞比例在HC(0-40.7)、AsC(2.2-32.2)、MCHB(0.2-15.6)、SCHB(0.6-32.0)、ACLF(0-6.36)组的中位数分别为23.9、12.2、1.9、4.4、0.39，随疾病严重程度的增加而显著降低(p＜0.05)。4．初步的功能实验显示，轻中度慢性乙型肝炎患者体内存在着一定程度的抗原特异性CD4+T细胞应答。在分别阻断HLA-DR/DQ/DP分子后，引发的HBcAg特异性CD4+T细胞极化应答存在差异。阻断HLA-DR或HLA-DQ后IFN-γ+CD4T细胞(HLA-DR，1.13-18.1vs0.02-1.26，中位数分别为10.5vs0.29，p=0.004; HLA-DQ，0.37-19.6vs0.02-1.26，中位数分别为10.79vs0.29，p=0.002)、IL-17+CD4T细胞比例(HLA-DR，0.03-0.55vs0.02-0.16，中位数分别为0.26vs0.07，p=0.03; HLA-DQ，0-0.57vs0.02-0.16，中位数分别为0.19vs0.07，p=0.085)均显著增加，而阻断HLA-DP后，IFN-γ+(0.34±0.39vs0.08±0.05，p=0.042)和IL-17+CD4T细胞比例(0.17±0.14vs0.01±0.01，p=0.012)显著降低,同时IL-4+CD4T细胞比例比阻断HLA-DR(0.1-7.29vs0.01-3.78，中位数分别为0.75vs0.16，p=0.044)后显著升高。总之，我们通过7色流式细胞技术对不同临床表型的慢性乙型肝炎患者和健康对照外周血DC表面的HLA-Ⅱ分子进行了检测分析，结果表明HLA-DR/DQ/DP在mDC和pDC表面并不是同等表达，mDC表面有四种主要的组合模式，CHB患者pDC表面还增加了DR-DQ-DP+模式。随着疾病严重程度的加重，慢性乙型肝炎患者mDC表面表达DR+DQ+DP+的细胞比例显著升高，pDC表面表达DR+DQ+DP+、DR-DQ-DP+的细胞比例显著升高，同时DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-细胞比例显著降低。在此基础上，我们进行了初步的功能实验，对HLA-Ⅱ分子不同等位效应进行了观察和研究，在分别阻断HLA-DR/DQ/DP后观察其后续激活病毒特异性CD4+T细胞的极化效应，结果提示HLA-DR/DQ和HLA-DP所引发的CD4+T细胞应答并不一致，HLA-DR/DQ提呈HBcAg后偏向活化IL-4+CD4T细胞，而HLA-DP提呈HBcAg后偏向活化IFN-γ+和IL-17+CD4T细胞。我们观察到3种HLA-Ⅱ分子表达模式存在差异，初步功能实验发现HLA-DR/DQ和HLA-DP对CD4+T细胞有差异的极化效应，深入探究引起mDC及pDC表面HLA-Ⅱ分子表达模式的差异及其递呈抗原后引发不同T细胞极化效应的内在机制，以及在慢性乙型肝炎病程中的具体作用等，仍需要进一步研究。