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目的: 为了研究DR_2566基因在耐辐射球菌极端抗性机制中的作用,本课题通过生物信息学方法分析、预测其生物学功能并利用同源重组的方法,将目的基因进行基因敲除,获得DR_2566缺失突变株。检测DR_2566在紫外辐射、过氧化氢、丝裂霉素C等极端抗性中发挥的作用,对DR_2566基因功能初步进行研究。 方法: 1.对DR_2566基因及其对应编码蛋白DR_2566的高级结构、理化性质、生物学功能等,使用生物信息学方法分析、预测。2.运用同源重组的方法构建DR_2566基因缺失突变株。 3.紫外辐照、过氧化氢及丝裂霉素C(Mitomycin,MMC)处理后,对野生型DR菌株、DR_2566基因缺失突变型DR菌株的生存率等进行分析,初步研究DR_2566基因在DR菌极端抗性中的功能。 结果: 1.生物信息学分析结果显示,基于整体核苷酸序列的搜索,没有发现其他生物的基因组中存在DR_2566的同源基因,这说明DR_2566为DR菌基因组中特有的基因。结构域分析结果提示, DR_2566为限制性内切酶家族(restriction_endonuclease_like superfamily)的一个成员,具有极短补丁修复(Very short patch repair,VSR)核酸内切酶Vsr功能(复制,重组和修复)。 2.成功获得了DR_2566基因上游片段、下游片段以及Kan抗性基因(含有GroEL基因启动子)的三个片段。将获得的三个片段通过T4连接酶连接三片段后的回收产物转化DR感受态,经卡那霉素Kan筛选,成功构建了DR_2566基因缺失突变株。 3.制作 DR_2566基因缺失突变株、野生株在紫外辐照、过氧化氢、丝裂霉素C处理下的存活率曲线,从中可以看出,DR_2566基因缺失突变株的存活率均明显低于其野生型菌株的存活率,其差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: DR_2566基因的缺失导致突变株对紫外辐射、过氧化氢、丝裂霉素C的敏感性增强,DNA修复能力有所减弱,提示DR_2566基因在DR菌极端抗性中发挥了一定功能。