尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物,大部分嘌呤在肝脏通过氧化代谢后变成尿酸,尿酸70%从尿液排除,30%从肠道排除。由于尿酸及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧很多疾病,高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节引起的急性炎症和疼痛是痛风的主要病因,严重痛风可引起关节功能障碍。尿酸可刺激血管平滑肌细胞增殖,导致内皮细胞功能障碍。血浆高尿酸是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素。高尿酸血症时尿酸沉积在肾小管会造成肾功能障碍,高水平的血浆尿酸也是急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾病炎症的主要危险因素。在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量裂解,胞内核酸大量降解,血浆尿酸急剧升高,引起以高尿酸血症为主的代谢紊乱和造成患者肾脏衰竭而死亡,此现象称为肿瘤裂解综合症。尿酸氧化酶(urate oxidase, uricase)是一种在嘌呤代谢过程中把尿酸分解为尿囊素,二氧化碳和过氧化氢的酶,可利用分子氧把尿酸氧化成过氧化氢和溶解度比尿酸高5倍以上的尿囊素。为尿酸代谢的关键酶。目前国外对尿酸酶的研究颇为迅速,在欧洲,已从黄曲霉制备的尿酸酶治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症的报告；其中一种重组黄曲霉尿酸酶被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征,但是尿酸酶又是一种外源蛋白,直接或重复使用易引发抗体降低疗效,而且易过敏,所以对于长期治疗,显然需要长效且无免疫原性的尿酸酶制剂,PEG化尿酸酶能够解决应用天然酶时遇到的这些问题,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是以CH2CH20为基础结构的大分子线性或分枝状多聚物。蛋白质的免疫原性由分子表面的抗原决定簇决定,PEG是一种线性、亲水、灵活且不带电的分子,当它与蛋白质的非必需基团共价结合时,可作为一种屏障,挡住蛋白质的抗原决定簇。低分子量的PEG(小于400Da)在体内经乙醇脱氢酶作用后能产生有毒的代谢产物,显示出毒性：但是,当PEG的分子量大于I000Da时其毒性就丧失。聚乙二醇具有免疫学惰性,即使分子量高达5.9×106Da,本身的免疫原性也很低。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联,影响蛋白质的空间结构,最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加,抵抗蛋白酶水解的能力提高,免疫原性和毒性降低或消失,体内半衰期延长,血浆清除率降低等。但目前国内治疗高尿酸血症所引起的相关疾病还是用经典的别喋呤醇或用丙磺舒等药物促进尿酸排泄和控制急性发作药秋水仙碱、非甾体类抗炎药等,用药期间大部分能使尿酸下降,但停药则反弹,需要长期用药,许多患者不能耐受药物的毒副反应而使病情加重；所以对目前的降尿酸治疗策略疗效不够理想。因此目前对降低血浆尿酸的药物市场上存在巨大需求；尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊索的高效排泄能力使尿酸酶成为治疗高尿酸血症的理想候选药物。从体内尿酸代谢机制推段,高尿酸血症应伴随血浆的高水平黄喋呤,而实验也证实高尿酸血症伴随着高浓度血清黄嘌呤。尿酸酶制剂比活性越高则治疗所需剂量越小,治疗的成本就越低且安全性反越有保障。因此,抗黄嘌呤且催化效力高的尿酸酶才是治疗高尿酸血症的理想药用尿酸酶。研究目的：将已构建好的工程菌BL21/pET28a进行诱导表达及表达后的目的蛋白通过多种分离纯化使其纯度达到96%及以上：然后将高纯度尿酸酶进行PEG化修饰并探索其最佳修饰条件；最后将修饰尿酸酶制备成冻干粉针剂。实验方法：首先用乳糖对BL21/pET28a进行诱导表达,在37-℃下诱导5h,得到的高效表达产物采用尿酸酶法及Brodford法测定其酶活性及蛋白含量,然后通过SDS-PAGE蛋白电泳测定其目的蛋白条带；再根据目的蛋白的等电点、离子强度等因素,首先选择阴离子交换层析纯化,阴离子交换层析适应于蛋白体积较大、蛋白浓度较高、且其分离效果较好、较易操作和有浓缩作用等特点使其除去一部分杂蛋白,再将回收目的蛋白液中加入硫酸钠.,通过增大离子浓度影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用,从而提高蛋白疏水性,通过疏水柱再次纯化,为了进一步分离不同聚合体形式和分离不同分子量而提高蛋白纯度,最后通过分子筛分离纯化,在每步纯化后都分别采用尿酸酶法及Brodford法测定其酶活性及蛋白含量,及通过SDS-PAGE蛋白电泳测定其纯化效果；然后对纯化尿酸酶进行mPEG-SC-10KD修饰,分别从尿酸酶和不同PEG摩尔比值对修饰反应的影响,不同尿酸酶蛋白浓度对PEG化修饰的结果,不同碳酸缓冲液PH值对PEG化修饰影响的结果,不同碳酸缓冲液浓度对PEG化修饰影响的结果这四个方面进行了研究；最后将修饰尿酸酶加入赋形剂,采用冷冻干燥法制备成粉针剂。实验结果：诱导表达产物经蛋白电泳检测在0.1M PH6.8磷酸缓冲液中为不可溶性蛋白,经10.14碳酸缓冲液复溶沉淀得到大小为33KD的目的蛋白,破碎全菌液通过酶活检测,与尿酸反应,测定其具有较高的活性11.7U/ml。用Brodford法测定尿酸酶蛋白含量为4.9ug/ul,比活为2.4U/mg,沉淀复溶液酶活性为11U/ml。蛋白含量为3.4ug/ul,比活为3.4U/mg,虽然两者比较比活性有所提高,但结果还是较低,这与尿酸酶蛋白的纯度不是很高有关,通过蛋白电泳图可以清楚的看到蛋白液中含有大量大肠杆菌内源蛋白,需要通过后期纯化得到纯度较高,比活高的尿酸酶。将不溶于磷酸而含有目的蛋白的沉淀溶于0.02M pHl0.14的碳酸缓冲液中,依次进行了三步层析纯化,蛋白比活力由上样前未处理的4.6U/mg提高到15.3U/mg,纯度较上样前提高将近四倍,纯度仍然很低,蛋白损失达20%以上；在通过疏水层析纯化纯度又提高了21倍,比活性达到50U/mg,除去绝大部分杂蛋白；最后通过分子筛分离纯化,最终将目的蛋白尿酸酶的纯度提高了26倍,比活性达到62.2U/mg,比文献中报道的48U/mg还要高出10U。通过SDS-PAGE电泳检测及凝胶系统条带测定其纯度达96%以上。采用PEG化修饰后的尿酸酶,其最佳修饰结果为pH9.16,0.02mol/l的碳酸缓冲液,酶浓度为8mg/ml,修饰剂以1：13.5的摩尔比为最优修饰条件。本实验用：mPEG-SC-10KD修饰剂进行修饰是根据其修饰剂分子量越大对抗原的屏蔽作用越理想,修饰后毒副作用较少,本身的免疫原性也很低；有动物实验研究mPEG-SC-5KD修饰剂因其对抗原的屏蔽作用不理想,修饰后毒副作用较多,所以一般用其进行预实验；而mPEG-SC-10KD修饰剂因其理想效果用于正式实验。最后通过冷冻干燥方法将修饰尿酸酶制备成2.0ml/瓶的粉针剂。结论：本实验成功表达出尿酸酶蛋白,并经多种分离纯化方法使其纯度达到及超过96%,探索PEG化修饰的最佳修饰条件并对其修饰后制备成粉针剂,为后期动物实验研究打下基础。