目的:(1)比较不同包被材料、不同培养条件对黑素细胞(Melanocytes,MCs)的纯化作用。探索方便、高效的MCs纯化的方法。(2)通过反复多次长时间胰酶(Long-term trypsinization,LTT)处理,获取表皮来源的应激MCs,即黑素细胞球(Melanocyte spheroids,MS)。探索MS在免疫荧光染色、免疫组化、亚细胞结构及致瘤性等方面的生物学特性。(3)采用三因子及四因子转染方法制备MCs来源的诱导多功能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs),观察其多能性标记及外胚层分化的潜能。方法:(1)将包皮组织、包皮的表皮组织及消化所得的细胞悬液,分别培养于层粘连蛋白或基质胶包被的培养板中,传代时进行差别胰酶处理,传代后加入G418或5-BrdU,通过MCs的标记性抗体HMB45荧光染色,观察MCs纯度。(2)获取表皮黑素细胞,当达到70-80%融合时,胰酶消化2h,存活的细胞用M254培养基重悬,接种在24孔板内;继续培养1周后,胰酶消化4h后重种;继续培养1周左右,当细胞达到80-90%融合时,胰酶消化6h,倒置显微镜下观察其成聚合状态。(3)用四因子(Sox2,Oct4,Klf-4,c-Myc)或三因子(Oct4,Klf-4,c-Myc)的慢病毒载体转染纯化或应激获得的MCs,对三因子及四因子生成的克隆进行干细胞标记相关抗体的免疫荧光染色及外胚层分化。结果:(1)原代培养中,细胞悬液比组织块获得细胞更多更快,单纯表皮比带真皮的组织块更早有细胞迁移并增殖;层粘连蛋白包被比基质胶包被更有利于MCs生长;差别胰酶处理以及加入一定浓度的G418或5-BrdU都可以纯化MCs,但后两种药物浓度较大时对细胞损伤明显。(2)多次LTT处理后获取的MCs,短期培养呈聚合状态,机械挑取MS至24孔板,单层MCs从细胞球边缘爬出,且MCs活性好,纯度高。(3)三因子及四因子转染都能成功,但是相比三因子转染,四因子转染形成的克隆多,并且克隆呈聚合状态。原代克隆干细胞相关抗体染色Sox2,Oct4阳性,代表神经元标记的相关染色不明显。结论:(1)采用层粘连蛋白包被板培养包皮来源的细胞悬液,传代时采用差别胰酶处理,传代后加小剂量的G418或5-BrdU,有利于MCs纯化,而不影响其生长。(2)MS免疫组化染色显示HMB45阳性,将MS皮下注射到小鼠大腿外侧,4个月后无黑素瘤形成,MS为细胞移植治疗白癜风提供了有望的前景。(3)三因子及四因子都能成功转染成iPSCs,表达大部分干细胞标记,体外诱导就外胚层诱导而言,只有少量的细胞诱导分化为神经元样细胞,nestin和b-III tubulin染色阳性。