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第一部分：端粒酶特异性抑制剂叠氮胸苷(AZT)对人多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226细胞)增殖和凋亡的影响目的：观察端粒酶特异性抑制剂叠氮胸苷(AZT)对人多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226细胞)端粒酶活性的作用,以及其对RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响。方法：将RPMI8226细胞1-5×106/ml接种于75mm2培养瓶中培养,细胞培养按对数生长期培养,我们再随机分为4组：空白对照组、细胞+AZT100uM组、细胞+AZT200uM组、细胞+AZT400uM组。常规传代培养进行下列检查：1)以端粒酶重复扩增法(TRAP):目的是对不同浓度的AZT作用以后,RPMI8226细胞的端粒酶活性变化的检测；2)细胞集落形成实验：了解及判断AZT对RPMI8226细胞增殖活性的关系；3)通过PCNA和P53的免疫细胞表达的检测,探讨AZT作用后对RPMI8226细胞增殖和诱导其凋亡的作用；4)用流式(FCM)和原位细胞凋亡检测法(TUNEL法),检测不同浓度的AZT对RPMI8226细胞的增殖和凋亡的影响；结果：1)端粒酶活性检测结果：AZT的各用药组的端粒酶活性都显著的低于对照组,尤其在AZT400uM组,其端粒酶的活性显著性下降,说明AZT对RPMI8226细胞的端粒酶活性可以有效的抑制,并且其抑制作用呈现剂量的依赖性。2)不同浓度的AZT作用后,其细胞集落形成实验证实,三个不同浓度的用药组的RPMI8226细胞的克隆形成都明显低于对照组,(P<0.01),尤其是AZT400uM组的克隆形成率明显的低于AZT100uM组、AZT200uM组(P<0.01),其差异有显著性。3)免疫组化结果显示：随着AZT浓度的增加,各用药组RPMI8226细胞的PCNA阳性细胞标记指数均明显有差异性(P<0.01)。P53阳性细胞标记指数均明显有差异性,实验的结果说明AZT可通过对RPMI8226细胞的端粒酶活性的抑制,能够有效的抑制其增殖,同时和诱导凋亡4) TUNEL检测结果证实：AZT的各用药组的RPMI8226细胞凋亡指数与对照组相比,差异有显著性(P<0.01)。流式细胞分析：各用药组RPMI8226细胞随着AZT浓度的增加,其凋亡也明显增多。以上结果说明AZT可通过抑制RPMI8226细胞的端粒酶活性,有效地诱导凋亡。结论：端粒酶异常活化是多发性骨髓瘤细胞获得无限的增殖与凋亡抑制的重要的原因。AZT(端粒酶抑制剂)有效的抑制多发性骨髓瘤细胞系(RPMI8226细胞)的端粒酶的活性,并且它的作用是呈剂量依赖性。第二部分：端粒酶抑制剂下调原癌基因C-MYC与细胞周期调控因子p14ARF的表达目的：初步探索端粒酶抑制剂下调RPMI8226细胞原癌基因C-MYC与细胞周期调控因子p14ARF的表达与细胞增殖和凋亡的相互关系,探讨C-MYC与p14ARF在该机制中的作用。方法：1)用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测用不同浓度AZT作用后,RPMI8226细胞C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的变化；2)Westen Blot方法检测在不同浓度的AZT作用后,它对RPMI8226细胞的C-MYC及p14ARF蛋白表达的变化。结果：1) RT-PCR检测结果,AZT各用药组的RPMI8226细胞C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的相对灰度值都明显低于对照组,而且,随着药物浓度的不断增加而相应下降。各组之间的比较均有显著性差异。直线相关分析,各组C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的相对灰度值与克隆形成率和PCNA、P53呈正相关(r=0.5286,P<0.01),与原位细胞凋亡标记和流式细胞检测得A%呈负相关(r=-0.5783,P<0.01).说明AZT可以通过端粒酶活性的抑制,使C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的表达下调,从而有效的发挥抑制增殖和诱导细胞的凋亡2) Wester blot检测结果,AZT各用药组的RPMI8226细胞系C-myc蛋白与P14ARF蛋白表达水平都明显低于空白对照组,而且随用药浓度的不断增加与作用时间的不断的延长而下降,与对照组相比,差异均有显著性。而在三个用药组,AZT100uM组、200uM组、400uM组C-myc蛋白和P14ARF蛋白表达均有显著性差异。经直线相关分析证实,各组C-mycm蛋白和P14ARF蛋白表达水平与细胞克隆形成率和PCNA呈显著性正相关,与经原位细胞凋亡和流式细胞检测到的凋亡指数(Al%)呈显著负相关。说明AZT通过抑制端粒酶活性下调C-MYC蛋白和P14ARF蛋白的表达,而发挥抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用。结论：1、RPMI8226细胞的端粒酶活性被抑制后,它能明显的下调RPMI8226细胞系的C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的表达,其表达与AZT浓度成正比。2、对照组与3个用药组的C-MYCmRNA和P14ARFmRNA的表达随着AZT浓度的增加而依次降低,与细胞的克隆形成率及PCNA及P53标记指数呈正相关,与肿瘤细胞的凋亡标记指数呈负相关。3、对照组与3个用药组的C-MYC蛋白和P14ARF蛋白的表达随着AZT浓度的增加而依次降低,与细胞的克隆形成率及PCNA及P53标记指数呈正相关,与肿瘤细胞的凋亡标记指数呈负相关。4、端粒酶再活化可通过直接或间接上调C-MYC和P14ARF表达,促进多发性骨髓瘤细胞增殖和抑制凋亡；AZT能有效的抑制端粒酶活性,并且扭转端粒酶的异常,主要通过肿瘤细胞增殖的抑制,同时诱导凋亡而发挥治疗作用。5、端粒酶为靶点的多发性骨髓瘤的靶向治疗在临床上有一定的临床价值