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酰胺酶具有十分严格的立体选择性,是合成手性羟酸及酰胺衍生物的重要工具酶。相比腈水合酶和腈水解酶,酰胺酶在工业应用中的潜力还未被开发出来。获得酰胺酶新酶源可以延伸腈水合酶的产业链,有利于构建以腈水合酶/光学选择性酰胺酶为基础的生物催化法制备手性化合物技术平台。本文围绕酰胺酶产生菌的筛选、菌种鉴定、底物特异性研究及转化条件的优化等展开。首先以基于酰胺酶酰基转移反应产物氧肟酸与Fe(Ⅲ)的螯合特性的高通量立体选择性酰胺酶筛选方法,筛选到13株立体选择性酰胺酶产生菌。菌株ZJB-09214鉴定为白地霉Galactomycesgeotrichum,为该种属菌中首次报道产酰胺酶的菌株,同时也是首次报道的能产胞外酰胺酶的菌株。优化了G.geotrichum ZJB-09214产胞外酰胺酶的发酵条件,获得较佳培养基组成为(g/L):葡萄糖10;酵母膏5;蛋白胨2;K2HPO41;KH2PO4 1;MgSO4.7H2O 0.2;FeSO4-7H2O 0.01;NaC11;乙酰胺1;pH7.5。同时考察了G.geotrichum ZJB-09214胞外酰胺酶转化丙烯酰胺的最适转化温度及pH,分别为35℃,7.5。酰胺酶底物特异性研究表明,G.geotrichum ZJB-09124胞外酰胺酶对脂肪族酰胺表现出明显的偏好,对正丁酰胺、异丁酰胺及乙酰胺的酶活分别为448.7、298.5及250.4 U/L发酵液。对(R,S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺及(R,S)-乙拉西坦表现iR-酰胺酶活性,ee值分别为91.2%及31.5%,E值分别为23.9及1.9。对(D,L)-蛋氨酰胺及(D,L)-色氨酰胺均表现为L-酰胺酶活性,ee值分别为99.9%及90.8%,E值分别为>200及28。对芳香族酰胺没有催化活性。菌株ZJB-09215鉴定为人苍白杆菌Ochrobactrumanthropi。考察了O.anthroOi ZJB-09215催化色氨酰胺合成L-色氨酸的转化条件。最佳转化条件如下:Tris-HCl缓冲体系(0.1 M,pH 8.0),菌体量为40 g/L,转化温度为45℃。底物浓度为90 mM,其酶活达到最大值160.3 U/L发酵液,几乎不存在产物抑制。该催化反应的表观动力学参数的Vm为 2.66×10-3 mol/L.min,米氏常数Km为 6.18×10-2 mol/L。O.anthropi ZJB-09215酰胺酶是一种广谱酰胺酶,对多种底物均具有催化活性,尤其对丙烯酰胺、乙酰胺及色氨酰胺,酶活分别为1784.1、632.5及261.7U/L发酵液,同时具有较严格的光学选择性,对(R,S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺、(D,L)-蛋氨酰胺及(D,L)-色氨酰胺的ee值均>98%。运用形态学、生理生化试验、ATB自动鉴定系统、16S/18SrDNA序列及系统发育分析将其余的5株菌分别鉴定为:ZJB-09212为代尔夫特食酸菌Delftia acidovorans,ZJB-09213为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae,ZJB-09219为肠杆菌菌Enterobacter oryzae,ZJB-09217为肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae,ZJB-09216与热带假丝酵母Candidatropicalis。其中阴沟肠杆菌E.cloacaeZJB-09213及肠杆菌菌E.oryze ZJB-09219是其所处种属中首次报道产酰胺酶的微生物菌株。K.pneumoniaeZJB-09217底物特异性分析表明该酶对脂肪族及部分杂环族酰胺具有明显的偏好,尤其是对脂肪族酰胺。其对乙酰胺具有很高的催化活性,酶活达1120.4 U/L发酵液。对(D,L)-色氨酰胺及(D,L)-蛋氨酰胺均表现出较严格的L-酰胺酶活性,ee值均为99.9%,E值均大于200。对(R,S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺表现R-酰胺酶活性,ee值及E值分别为97%及130。对芳香族酰胺则完全不具催化活性。