前言 在研究牛精浆蛋白(bovine seminal plasma，BSP)及其相关蛋白在受精卵发育过程中的重要作用时，我们在人睾丸组织中发现并克隆了一个与BSP蛋白相关的新的精子结合蛋白基因的cDNA序列，将其命名为TSBP(Testis Sperm Binding Protein)，并在GenBank注册，登录号为AF279147。其开放阅读框架(open reading frame，ORF)编码了一个含223个氨基酸残基的蛋白质，其氨基酸序列中含有7个外显子、6个内含子及四个纤连蛋白Ⅱ型结构域，与BSP蛋白在结构上有一定的相似性，预测该蛋白是与BSP蛋白功能相关的精子结合蛋白。我们已确定了该基因在人肾、肝、脾、肠、胃、胰腺、骨骼肌、心肌、脑、肺等11种组织中均有阳性表达；其原核表达获得大量表达蛋白，并已进行测序。BSP蛋白是牛精浆中的主要蛋白质，目前已知BSP蛋白可与胆碱或磷脂胆碱结合，黏附于精子表面，促进由肝素、HDL等诱导的精子获能过程，BSP蛋白还可与不同来源的胶原、纤维蛋白原、肝素、钙调蛋白、IGF-Ⅱ、apoA-Ⅰ等结合，可抑制精子细胞膜上的胆固醇迁移，这些都表明BSP蛋白在精子胞膜的脂类代谢、调节精子获能以及顶体反应等多方面发挥重要作用。在以前的研究中，我们从牛精子中纯化了一个蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)的抑制剂，但经测序发现与BSP蛋白的基因序列完全相同，我们又进一步对BSP蛋白与PKC间的关系展开了较深入的研究，发现BSP蛋白不仅能抑制PKC的活性，还能抑制酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，TPK)的活性。在猪和马的精浆中都发现了与BSP蛋白同源蛋白质的存在，这些同源蛋白具有与BSP蛋白相似的结合特性，说明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳动物中是广泛存在的，并有其生理意义；而在人的生殖系统中与BSP蛋白相关的蛋白未见报道。因此，对BSP及与其功能相关的人新的精子结合蛋白ISBP的定位及功能的研究无疑是—个重要的课题。材料勺方法 1.材料与试荆 新鲜人全血取自辽宁省计划生育科学院生殖医学盆点开放实脸室进行染色体检侧的人员;载体连接系统沁以一X一、PcD啊月3、沁跳一公叮购自枷叫笋公司;红色荧光蛋白衰达峨体润加肠目l书l劝自口刀栩佗CH公司;大肠杆菌JMI份、BL.21感受态细饱、FCR扩增试荆t、限翻性内切.肠口Hl及X加I、质粒DNA快邃抽提纯化试荆盒功自协止.，;碗声诫认助画时的M让、如‘戒邵咬卿如司加脱即‘.试荆盒劝自肠鸽肠公司;班、以18、竹飞及P鱿C活性侧定试荆均为与，.公司产晶，O啊A连接试荆t劝自九川娜;脂质体转染试荆“洲吻吻如产岌以李劝自玩，枷，.，人胚肾H万粗仍细胞由协和医科大学细启生钧徽研盆扭供。 2.荧光原位杂交 以沁以一X一上克隆的竹BP为模板，用其特异引物pCR扩增得到cDNA，缺口平移法出即向娜血标记探针，并使其变性;常舰人二倍体染色体G显带标本栩备，并变性;探针与染色体杂交，用可代喃娜喇画戒，向脚加助d场街检侧，再用竹复染，于炙光且徽镜下观寮杂交佑号。 3.亚细胜定位 以沁以一X·1上克滋的盛犯P为棋板，用其特异引物护CR扩增，3’端引人X加I醉切位点，，’端引人B.Hll切位点，克隆到杯超鱿.T公叮段体上;选用NH:端连接的红色荧光蛋白段体川、肠目1书1与竹右护同时用肠.HI、X肠I双阵切，进行分离、纯化、连挂，获得，组川、Rdl书1广胜沼护质狡，用通用引物对，组峨体川、场闭l书l月份BP进行双向洲序。转染H公心沙3细胞，经G418筛选，获褥称定农达其核细班系，传代、培养，在炙光显徽镜下观察皿犯P受白衰达，确定其理细几定位。 4.功能位侧 以川以心x-1上克隆的皿妇P为棋板，用其特异引物只流扩增，3’端引人肠口Hl璐切位点，5’端引人X肠l阵切位点，克隆到声心才卜叮级体上;选用FcDN朋为续体与竹对P同时用肠.H IJ肠I双醉切，进行连接，获得盆组PcDNA3月习护质狡，用通用引物对t组段体氏侧灿以八匀护进行双向侧序。转染HE]忆沙3细胞，经G418筛选，获得稼定衰达真核细班系，传代、培养，用于功能检测，检测前要鉴定目的基因在细胞中的表达。 4.1 PKC活性测定: 将稳定转染的细胞及未转染和空质粒转染的对照组细胞分别加人裂解缓冲液将裂解物以120009离心5而n，收集上清，分别加人·PKC反应液20闪，其中PKC特异底物为MARCKS，37℃水浴30而n后，加人等量样品缓冲液终止反应，巧%SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳将MARCKS分离出来，晾干后放射自显影，凝胶分析系统读取MARCKS相应自显影带，表示PKC的活性。 4.2开K活性测定 稳定转染的细胞及未转染和空质粒转染的对照组细胞处理方法同PKC活性测定，只是TPK的底物为谷酪复合物。30℃水浴30而n后，将反应混合物点到Wha加an Psl阳离子交换滤纸上，然后用75~1 H3P04终止反应，再用75~ol磷酸盐洗三次每次2而n，取出滤膜干燥，放人snil去离子‘水的液闪瓶中，液闪仪检测cPm值。未转染细胞组加人TPK抑制$J.Genistein，作为，rPK活性对照。实验结果 1.染色体基因定位 在普通光学显微镜下观察人46条中期染色体，经人类染色体分析与识别系统V