背景及目的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,广泛存在于脐带血、外周血及骨髓中,参与缺血性疾病血管新生和损伤后的血管内皮的愈合修复。当血管受到损伤后,EPCs从骨髓中释放进入外周血中,迁移至损伤部位,然后增殖分化为成熟内皮细胞,促进损伤血管再内皮化。已有的大量研究表明,随着年龄的增长,EPCs数量减少,其粘附、增殖、迁移和血管形成等功能也随之衰退。这一结论表明年龄的增长使EPCs呈现细胞衰老表型,但其确切的作用机制仍不清楚。Micro RNAs(mi RNAs)是一类长度约为22个核苷酸左右的单链内源性非编码小RNA,广泛存在于动物及植物中。mi RNAs能够通过与其靶基因的3′端非编码区(3′untranslated region,UTR)进行完全或不完全互补配对的方式直接降解其靶基因或者对其靶基因进行转录后调控,从而参与细胞存活、衰老、增殖、分化、迁移等重要的细胞生理过程。mi RNAs的异常表达与多种疾病如心血管疾病等密切有关,而心血管疾病与EPCs又有着密切的关系。近年来,EPCs的衰老与mi RNAs的关系受到人们的重点关注,如Zhao及其同事报道mi R-34a通过抑制沉默信息调控子1(Sirt1)的表达,加速EPCs的衰老,并降低细胞血管形成能力。Zhu课题组研究发现mi R-10a和mi R-21通过靶向Hmga2来调节小鼠EPCs的衰老、迁移、增殖、自我更新和体内外血管形成能力;该研究的芯片结果也显示mi R-22在小鼠老年组中表达量要高于小鼠年轻组。那么,mi R-22在人老年组中是否也是高表达?mi R-22是否在EPCs衰老过程中发挥生物学作用呢?为了解决这些问题,我们首先设置了年轻组(21岁左右)和老年组(66岁左右)两组样本,分离出EPCs,然后采用多种研究方法来研究mi R-22对EPCs的细胞衰老、增殖、迁移和血管形成的影响。通过预测软件的预测和生物信息学分析,推测Akt3可能是mi R-22的潜在靶基因,最后采用各种实验方法探讨Akt3与mi R-22之间的关系,从而来阐明mi R-22对EPCs衰老的作用机制。方法(1)本研究设置两组样本,一组是年轻组(21岁左右),一组是(66岁左右),每组各3个样本,采取其外周血,然后采用密度梯度离心法(淋巴分离液Ficoll)来分离外周血,获得单个核细胞,最后运用贴壁分离法获得较纯的EPCs。(2)采用Di I-AC-LDL和FITC-UEA-I双荧光法和表面抗原CD133、CD31和CD34检测,对分离的EPCs进行鉴定。采用荧光定量PCR(q RT-PCR)实验方法检测mi R-22在年轻组和老年组中的表达量。(3)采用分子生物学方法构建慢病毒载体p LVTHM-mi R-22和p LVTHM-anti-mi R-22,然后与病毒包装质粒共同感染293T细胞,收集上清,检测病毒滴度。(4)慢病毒Lv-mi R-22和Lv-anti-mi R-22分别g感染青年组和老年组EPCs,采用q RT-PCR实验方法检测转染慢病毒的青年组和老年组EPCs中mi R-22的表达量,采用β-半乳糖苷酶检测、MTT增殖法、transwell细胞迁移法、体外血管形成检测来检测和观察转染后青年组和老年组EPCs的衰老、增殖、迁移和血管形成等生物行为的变化。(5)利用Target Scan,mi Randa和Pic Tar靶基因预测软件,预测出Akt3可能是mi R-22的一个潜在的靶基因。利用双荧光素酶报告基因试验验证mi R-22对Akt3的负向调控作用。Mi R-22在年轻组EPCs中过表达或老年组EPCs中抑制表达后利用q RT-PCR和免疫印迹实验检测Akt3 m RNA和蛋白水平的变化。(6)构建Akt3和Akt3-3′UTR慢病毒载体,感染年轻组EPCs-mi R-22稳转株后,检测其衰老、增殖、迁移和血管形成等生物行为的变化。结果(1)刚分离的单个核细胞形状呈圆形,且体积很小,1天后可见贴壁细胞形状呈较粗的圆形、椭圆形或不规则形。培养7天后,长梭形的内皮样细胞数增多且体积也增大,部分视野中可见由数个细胞形成的细胞集落。(2)在激光共聚焦显微镜下观察到分离得到的单个核细胞分化到第7天出现橙黄色双染阳性细胞,表明细胞摄取了Di I-AC-LDL和FITC-UEA-I并证实了橙黄色双染阳性细胞为正在分化的EPCs。(3)流式细胞仪检测表面抗原CD133、CD31、CD34和VEGFR-2,阳性率分别为33.3%、51.7%、45.4%和47.2%。(4)老年组mi R-22的表达量明显高于年轻组。(5)年轻组和老年组EPCs分别感染mi R-22和anti-mi R-22慢病毒后,与对照组相比,感染mi R-22的年轻组中mi R-22表达量显著上调,衰老细胞数明显增加,细胞增殖、迁移和血管形成能力明显下降;另一方面,感染anti-mi R-22的老年组中mi R-22表达量明显下降,衰老细胞数也明显下降,其增殖、迁移和血管形成等生物学功能却上调。(6)荧光素酶报告基因实验证实,mi R-22可以抑制野生型Akt3-3′UTR-WT的荧光报告基因的活性,而对突变型Akt3-3′UTR-MUT没有影响。此外,mi R-22过表达引起Y-EPCs中Akt3的基因和蛋白质水平的表达明显低于对照组,而anti-mi R-22导致A-EPCs中Akt3的表达水平明显上调。(7)Akt3过表达能够逆转mi R-22对Y-EPCs的增殖、迁移和血管形成的抑制作用和对细胞衰老的促进作用。结论(1)mi R-22在A-EPCs中表达量明显升高。(2)mi R-22促进EPCs衰老,抑制其增殖、迁移和血管形成能力。(3)mi R-22通过抑制其靶基因Akt3的表达来促进EPCs的衰老。